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RNAi基本情報 (手法)

記事ID : 11405

細胞への導入


トランスフェクション方法の決定

合成 siRNA または si/shRNA 発現ベクターのいずれを用いて RNAi 実験を行う場合にも、細胞内にこれらを導入する必要があります。 使用する細胞系の培養設備が整っていれば、あとはトランスフェクションの系を確立すればよいことになります。

弊社では、さまざまなトランスフェクション試薬をご用意しています。RNAi実験での使用実績の多いGenlantis(GEN)社 GeneSilencer siRNA Transfection Reagent がオススメです。サンプルもご用意しております。

合成 siRNA およびプラスミドベクターを使用する場合
一般的には一過性の反応であるため、できるかぎり高いトランスフェクション効率での実験が望まれます。使用する細胞の導入効率や細胞毒性などの性質 によって、トランスフェクション試薬の種類、あるいはエレクトロポレーションを用いるかを決定します。

トランスフェクション条件の検討

トランスフェクション試薬を用いる場合(以下一例。詳細はご利用のトランスフェクション試薬のプロトコール参照)

  (1) 6ウェルプレートに24時間後に50〜70%confluentになるように細胞を播種する。

  (2) ポジティブコントロールsiRNA(100μMストックを1μL)をMEM(血清無添加)に加えて100μLとする。GFPなどのレポーターベクターがある場合は、co-transfectionしてもよい。

  (3) 種々のトランスフェクション試薬濃度の溶液を調整する。
      A:トランスフェクション試薬1μLと培地(血清無添加)を加えて100μLとする。
      B:トランスフェクション試薬2μLと培地(血清無添加)を加えて100μLとする。…など

  (4) (3)で調整したトランスフェクション試薬溶液に、(2)のsiRNA溶液を各100μLずつ添加、混和し、室温で15分程度放置する。

  (5) 細胞を培地で洗浄後、培地(血清無添加)を0.8ml添加する。

  (6) (4)で調整したsiRNA-トランスフェクション試薬複合体をそれぞれのdishに滴下する。

  (7) 数時間培養する。

  (8) 通常使用している倍量の血清と抗生物質を含むMEMを1mL添加して、24〜48時間培養する。実際には、トランスフェクション試薬やsiRNA導入により問題が生じないかを確認するために、siRNA存在下、非存在下の両方で検討するとよい。細胞毒性が低く、かつノックダウン効果の高い条件を選択する。

トランスフェクション条件の検討
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。


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