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セルバイオラボ社 レトロウイルスによる遺伝子デリバリー

記事ID : 6962
研究用

1. リコンビナントレトロウイルスの作製


セルバイオラボ社 レトロウイルスによる遺伝子デリバリー プロトコール内で使用した商品

レトロウイルスの一般的なワークフロー

  Amphotropic Ecotropic Pantropic*
Human +++ N.S. +++
Mouse +++ +++ +++
Rat +++ +++ +++
Monkey +++ N.S. +++
Cat +++ N.S. +++
Dog +++ N.S. +++
Hamster + N.S. +++
Bird N.S. N.S. +++
Fish N.S. N.S. +++
Frog N.S. N.S. +++
Insect N.S. N.S. +++
Mollusk N.S. N.S. +++
*Virus must be packaged with a pantropic envelope protein such as VSVG.
N.S. = Not Suitable

Platinum Packaging Cell Line を用いたレトロウイルス発現システム
Platinum Packaging Cell Line はpol-gag 遺伝子およびenv 遺伝子(注1)が含まれています。

注1)Plat-GP Cell Line にはenv 遺伝子は含まれません。

使用するキット

● Platinum-E Packaging Cell Line(品番:RV-101)
● pMXs-miRNA-GFP/Pur Retroviral Vector(品番RTV-017)

プロトコール

I:Plat-E パッケージングセルラインの培養

1.凍結細胞からPlat-E の起こし方

1.37℃のウォーターバス内で凍結細胞をすばやく溶かします。溶かした細胞を10mLの培養培地が含まれる15mLのチューブに懸濁します。

2.チューブを1,300〜1,500rpmで遠心します。

3.上清を捨て,指で軽くたたいて細胞のペレットを壊します。

4.数滴の培地を加え,緩やかに混合し,数回指でタッピングします。

5.2mLの培地をチューブに加え,緩やかに2回ピペッティングします。

6.細胞懸濁液を8mLの培地が入った10cm培養ディッシュに加えます。

7.円を描くようにディッシュをゆっくりと動かし,細胞を混ぜ,2-3日間培養します。
※完全なコンフル状態まで培養しないでください。70-90%コンフルになったら,2-3日毎に4xまたは6xに分けてください。
※培養操作中は,できるだけ泡ができないように気をつけてください。

2.細胞の分割

1.細胞が70-90%コンフルになったら,細胞をPBSで洗浄します。

2.4mLの0.05% Tripsin / 0.5mM EDTA をディッシュに加え,37℃で3-5分間インキュベートします。

3.ディッシュのふちをタッピングし,ディッシュの表面から細胞を剥がします。

4.10mLの培地を50mLチューブに入れます。

5.同じピペットを使って,ディッシュの表面をやさしく3回,4mLのTripsin / EDTA で洗浄します。

6.細胞の懸濁液を7回,ゆっくりとピペッティングし,懸濁液をステップ4の培地の入った50mLチューブに入れます。

7.細胞を1,300-1,500rpmで遠心します

8.上清を捨て,指で軽くたたいて細胞のペレットを壊します。

9.数滴の培地を加え,緩やかに混合し,数回指でタッピングします。

10.5mLの培地をチューブに加え,緩やかに2回ピペッティングします。

11.15mLの培地を加え,細胞の数を数え,細胞を播きます。通常,10cm ディッシュ1枚あたり107 細胞です。

II:レトロウイルスの作成

1.クローニングトランスフェクション

1.目的遺伝子をレトロウイルスベクターにクローニングします。miRNA precursor のクローニング方法はセルバイオラボ社 アデノウイルスによる遺伝子デリバリー(1. リコンビナントアデノウイルスの作製)をご参照下さい。

※または,キットに含まれるpMX-GFP をコントロール実験用に使用します。

2.トランスフェクションの1日前に2x106 細胞を60mm 培養ディッシュに抗生物質を入れずに培養します。

3.16-24時間後,トランスフェクションを開始し,70-80%コンフルになるまで,培養します。
※細胞へのトランスフェクションは,FuGENE® Transfection reagent やLipofectamine™ Plusなどの試薬をご使用いただけます。トランスフェクションの条件は,各試薬のマニュアルをご参照ください。

4.トランスフェクション後48時間,レトロウイルスウイルス上清を培養してください。

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