記事ID ： 45532

ヒトMSC由来CD90陽性CD63陽性エクソソームを直接定量！ CD90/CD63 Exosome ELISAキット

メーカー名：株式会社ハカレル

　エクソソームは生体を構成するほぼすべての細胞から分泌される直径30~200nmの小胞で、血液や尿などあらゆる体液中に存在します^(1)～(5)。また、in vitroでは動物細胞の培養上清にも分泌されます。エクソソームは細胞と同様に脂質二重膜に包まれており、その表面には膜タンパクが存在し、また、内部にはタンパク質やマイクロRNAなどが包含されています。エクソソームを取り込んだ標的細胞において、これらのタンパク質やマイクロRNAが機能することによって、エクソソームは細胞間のコミュニケーションを担っていると考えられます⁽⁶⁾。エクソソームの構造上の特徴の一つとして表面上に存在するテトラスパニンファミリーが挙げられます。CD9、CD63及びCD81はそのメンバー分子で、エクソソームの表面マーカーでもあります⁽⁷⁾。
ヒト間葉系幹細胞（human Mesenchymal Stem Cells, hMSC）は、組織再生活性と免疫調節活性の両方を備えた多能性細胞であり、細胞治療の魅力的なツールとなっています。ここ数年、hMSCの有益な効果はパラクリン効果によるものであり、少なくとも部分的には細胞外小胞（エクソソームなど）によって媒介される可能性があることが示されています^{(8), (9)}。
　エクソソームの定量法としては、エクソソームが含むタンパク量で代替したり、ナノトラッキング法による粒子解析がありますが⁽¹⁰⁾、これらの方法は超遠心法などで一旦エクソソームを精製する必要があります。体液中や細胞培養液中のエクソソームを直接定量する手段は極めて限られており、これまで一般的な方法は開発されてきませんでした。

　本キットは、hMSCでもっとも発現量が多いとされているテトラスパニンであるCD63及びMSC由来エクソソーム・マーカーとして提案されているCD90⁽¹¹⁾に対するそれぞれの高性能抗体を利用し、ヒトMSCが分泌するCD90陽性かつCD63陽性エクソソームを検出する2ステップサンドイッチELISAキットです。

特長

ヒトの細胞培養上清などに含まれるCD90陽性CD63陽性エクソソームを直接定量可能
特殊な装置は不要で、通常のプレートリーダーがあれば測定可能(波長450nm)
標準試薬として保存安定性に欠けるエクソソームそのものを使用せず、CD90/CD63融合タンパク質（標準タンパク質）を利用することで安定性と再現性を確保
CD90/CD63融合タンパク質(標準タンパク質)を用いた標準曲線で読み取ることで各サンプルの相対定量が可能
固相化したCD90抗体とHRP標識したCD63抗体を用いて、2ステップサンドイッチ法でCD90 陽性CD63陽性エクソソームを検出

構成内容

	内容	容量	数量
1	抗CD90抗体固相化プレート	96well (8well x 12 strips)	1枚
2	標準タンパク質 (CD90/CD63融合タンパク質)	200µL	1本*
3	アッセイバッファー	25mL	1本
4	洗浄バッファー (10倍濃縮)	25mL	1本
5	HRP標識抗CD63抗体 (500倍濃縮)	20µL	1本
6	基質液	12mL	1本
7	停止液(2N H₂SO₄)	6mL	1本
8	プレートシール		2枚

*n=2として、検量線4回分

保存温度：冷蔵（２～８℃）

データ例

図1. MSC培養上清中のCD90/CD63陽性エクソソーム量のタイムコース
不死化MSC細胞であるUE6E7T-3細胞を12穴ディッシュにPOWEREDBY10培地1mL中1.0×10⁴cells/cm²で播種し、1日1穴ごとに回収した培地を2,000xgで5分間遠心してデブリを除き、凍結保存したものを希釈せずそのまま本キットで測定した。

参考文献

J. Skog, T. Wurdinger, S. van Rijn, D. H. Meijer, L. Gainche, M. Sena-Esteves, W. T. Jr. Curry, B. S. Carter, A. M. Krichevsky and X. O. Breakefield: Nat Cell Biol., 10, 1470 (2008).
T. Pisitkun, R. F. Shen and M. A. Knepper: Proc Natl Acad Sci USA., 101, 13368 (2004).
S. Runz, S. Keller, C. Rupp, A. Stoeck, Y. Issa, D. Koensgen, A. Mustea, J. Sehouli, G. Kristiansen and P. Altevogt: Gynecol Oncol., 107, 563 (2007).
S. Keller, A. K. Konig, F. Marme, S. Runz, S. Wolterink, D. Koensgen, A. Mustea, J. Sehouli and P. Altevogt: Cancer Lett., 278, 73 (2009).
C. Lasser, V. Seyed AlikhS. Gabrielsson, J. Lotvall and H. Valadi: J Transl Med.,9, 9 (2011).
Y. Naito, Y. Yoshioka, Y. Yamamoto and T. Ochiya: Cell Mol Life Sci., 74, 697 (2017).
A. Zoraida and M. Yanez-Mo: Front Immunol., 5, 442 (2014).
V. Filipe, A. Hawe and W. Jiskoot: Pharm Res., 27, 796 (2010).
S. Rani, A. E. Ryan, M. D. Griffin and T. Ritter: Mol Ther., 23, 812 (2015).
V. Filipe, A. Hawe and W. Jiskoot: Pharm Res., 27, 796 (2010).
M. Théry et al.: J Ext Vesicles, 7, 1535750 (2018).

CD90/CD63 Exosome ELISA キット

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
ヒトMSC由来エクソソーム定量　CD90/CD63 ELISAキット / CD90/CD63 Exosome ELISA Kit, Human	HAK	HAK-HEL9063-1	1 KIT [96test]	￥120,000

【関連サービス】

本キットを使用したELISA測定受託サービスについては下記をご覧ください。

ハカレル社　エクソソーム定量解析受託サービス

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データ例

図2. CD63のWB解析
サンプル：不死化ヒト間葉系幹細胞株UE6E7T-3 細胞抽出液(5µg/レーン)
１次抗体に本抗体(マウス抗ヒトCD63モノクローナル抗体、クローンNo. A1-9A2)、2次抗体にHRP標識抗マウスIgG抗体を用いてウェスタン・ブロッティングを行った。

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
マウス抗ヒトCD63抗体, 100μg / Anti CD63, Human (Mouse) Unlabeled, A1-9A2	HAK	HAK-ANTI-CD63-A1-9A2	100 UG [1mg/mL]	￥55,000

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データ例

図3. CD90のWB解析
サンプル1: CD90導入Expi293細胞の培養上清から精製したエクソソーム(1µg/レーン)
サンプル2: 不死化ヒト間葉系幹細胞株UE6E7T-3 細胞抽出液 (10µg/レーン)
１次抗体に本抗体(マウス抗ヒトCD90モノクローナル抗体、クローンNo. A6-10G9）、2次抗体にHRP標識抗マウスIgG抗体を用いてウェスタン・ブロッティングを行った。