フローサイトメトリーや免疫染色で有用！性質、選び方、使い方について解説します アイソタイプコントロール（Isotype Control）

フローサイトメトリー（FC：Flow Cytometry）や免疫組織化学染色（IHC：Immunohistochemistry）等の抗体実験において、結果の妥当性の検証時に有用な各種アイソタイプコントロール（Isotype Control）を販売しています。本稿では、アイソタイプコントロールの性質、選び方や使い方について解説します。

［タグ抗体］HisタグやDDDDKタグ融合タンパク質の検出に！
［コントロール抗体］Beta ActinやGAPDHのルーチン実験に！
［二次抗体］31品目のベーシックな二次抗体、プロテインA、ストレプトアビジン

■ 抗体実験のコントロールについて

抗体試薬は、通常であれば特定の抗原やタンパク質に結合しますが、他のタンパク質や細胞成分に非特異的な結合を示す場合があります。抗体によるオフターゲットすなわち非特異的結合は、抗原特異的染色とバックグラウンド染色の判別を困難にするため、『偽陽性』の結果を招く原因となります。したがって、信頼できる結果を保証するには、染色に用いた抗体がオフターゲットを示すかどうかを判断するための実験的なコントロールを常に含めることが重要です。

■ アイソタイプコントロールとは?

アイソタイプコントロールは、抗体染色実験のネガティブコントロールとして使用される抗体です。アイソタイプコントロールは、実験で使用される一次抗体と同じ免疫グロブリン（Ig）クラス/サブクラスを持つ一方、目的タンパク質に対する特異性を欠いています。

図. ターゲットに対して結合性を持つ標識一次抗体（左）と結合性を持たないアイソタイプコントロール（右）

抗体試薬は、他のタンパク質、内因性酵素、脂質、およびFc受容体に非特異的に結合する可能性があります。アイソタイプコントロールを使用することによって、抗体による特異的染色とバックグラウンド染色を区別することができます。また、プロトコールのブロッキングや洗浄ステップが十分であるかどうかの判断にも有用です。

■ アイソタイプコントロールの選び方は？

アイソタイプコントロールの『宿主動物（免疫動物）』『免疫グロブリン（Ig）クラス/サブクラス（アイソタイプ）』『標識物質』は、使用する一次抗体と同じである必要があります。

例えば、FITC標識されたマウス由来IgG2bをアイソタイプに持つ抗体を一次抗体に用いる場合は、FITC標識されたマウス由来IgG2bアイソタイプコントロール抗体を選択します。

非標識の一次抗体を二次抗体で検出する場合は、非標識のアイソタイプコントロールを選択します。さらに、二次抗体のみのコントロール（一次抗体をPBS等のブランクにして二次抗体のみで染色する）を追加することで、二次抗体のバックグラウンド染色を決定します。

図. ターゲットに対して結合性を持つ一次抗体+標識二次抗体（左）と結合性を持たないアイソタイプコントロール+標識二次抗体（右）

■ アイソタイプコントロールを使用するアプリケーションとは?

アイソタイプコントロールは、FC（フローサイトメトリー）、IP（免疫沈降）、IHC（免疫組織化学）で最も一般的に使用されます。WB（ウェスタンブロット）、IF（免疫蛍光染色） 、ICC（免疫細胞化学）、ELISA等の他のアプリケーションでは、ブロッキングやコーティングの目的にも使用できます。

■ アイソタイプコントロールの使い方は?

使用方法（プロトコール）は、一次抗体をアイソタイプコントロールに置き換えるだけです。プロトコールの他の箇所は、一次抗体を用いて実際に検出するサンプル（実験サンプル）とアイソタイプコントロールサンプル（コントロールサンプル）で全く同一になります。また、コントロールサンプルは、実験サンプルと全く同じ条件下で処理される必要があります。抗体濃度に関しても、一次抗体と同じ濃度でアイソタイプコントロールを調製してください。二次抗体を用いて検出する場合は、コントロールサンプルを実験サンプルと同じ二次抗体で染色してください。

• 50種類以上のアイソタイプコントロール抗体
• 非標識または標識製品：FITC、PE、APC、CoraLite®488、CoraLite®594、CoraLite®647
• 動物種：マウス、ラット、アルメニアンハムスター

以下にアイソタイプコントロールを使用した場合のデータ例を示します。
アイソタイプコントロールを使用することで、APC標識CD4抗体によって特異的に染色されたCD4+（陽性）細胞集団を容易にゲートすることができます。

1X10^6ヒト末梢血リンパ球（未固定）を用いて、0.06 µgのAPC標識抗ヒトCD4抗体（品番：APC-65134、クローン：OKT4）（橙）、0.06 µgのAPC標識マウスIgG2bアイソタイプコントロール（品番：APC-65128、クローン：MPC-11）（赤）、試薬のブランクコントロール（青）で細胞表面を染色した。

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