【テスト】OptiPrep™ | アプリケーションのご紹介

OptiPrep™ を用いて密度を調製た血漿にOptiPrep™ を重ねて遠心した。単核細胞は密度バリアの最上部に浮上し、赤血球および多形核白血球（PMNs）は血漿のロード位置に留まった。
右図は単核細胞懸濁液に血小板が完全に欠如していることを示す。
（参照：Application Sheet C06）

マウス、ラット、ウサギ由来のPBMCの密度は、ヒト由来のものよりもわずかに高いと考えられています。これに対応するために分離媒体の密度を高めるとPBMCの回収率は良好になりますが、PMNsによる汚染が生じます。
この問題を解決する代替戦略として、
1. 分離媒体の密度を1.077 g/mLに維持しながら、浸透圧を調整する方法
2. 浮遊法（右図）があります。

好塩基球を除いて、ヒト末梢血中の多形核白血球 (PMNs) の密度は主に 1.080 g/ml を超えていますが、単核細胞 (MC) の密度は 1.077 g/ml 未満です。赤血球の密度はより密度の高い好中球の密度と大幅に重複するため、単一ステップ法を使用してヒト全血から PMNs を分離することは容易ではありません。Optiprep™を用いることで、PMNsをペレット化ではなくバンド化することができます。

Iodixanolの浸透圧は多くのウイルスと類似しています。一方、スクロース溶液や塩化セシウムはウイルスより高浸透圧のため、ウイルスから水が失われ、密度が増加する要因となります。

自己形成グラジエントによるウイルスの精製のプロトコール概要（右図）

• 50％（w/v）OptiPrep™ クッションの上にウイルスを重ねる（step1-2）
• クッションと同等量を除くすべての上清を廃棄する（step3）
• 残りの液体を混合後、（準）垂直ローター用のチューブに移し、350,000gで約3時間遠心する。遠心中に勾配が形成され、ウイルスは自身の平衡密度に移動する（step4-5）

軽ミトコンドリア画分から細胞小器官（ゴルジ膜、リソソーム、ミトコンドリア、ペルオキシソーム）を分離することが可能です。スクロース勾配より浸透圧および粘度が低いため、分離能が向上します。

ヒト血漿リポタンパク質の分離

血漿リポタンパク質は密度によって高密度（HDL）、低密度（LDL）、および超低密度（VLDL）に分類されます。各クラスを浮遊分離する方法として、KBrまたはNaCl/KBr混合物を溶解して血漿の密度を段階的に上昇させる手法が広く使用されてきました。しかし、この操作は少なくとも3日要し、分析時には透析による塩の除去が必要となります。
一方、1996年に導入されたIodixanol勾配は数時間の遠心で完了し、Iodixanolは無毒で非イオン性であるため、分析時に媒体を除去する必要がありません。

カイロミクロンを含まない血漿とOptiPrep™ を混合し、2.5時間遠心した。最も密度の高いHDLは、最底部にバンドを形成する可溶性タンパク質と融合するが、VLDL、LDL、HDLの3種類はほとんど重ならずに分離された。右図に寒天ゲル電気泳動結果を示す。
（参照：Application Sheet M07）