3. アデノ随伴ウイルスの精製

セルバイオラボ社 アデノ随伴ウイルスによる遺伝子デリバリー　プロトコール内で使用した商品
    AAV-DJ ヘルパーフリー発現システム （品番：VPK-410-DJ）
    293AAV Cell Line （品番：AAV-100）
    ViraBind™ アデノ随伴ウイルス精製キット （品番：VPK-140）
    QuickTiter™ アデノ随伴ウイルス定量キット （品番：VPK-145）
    ViraDuctin™ アデノ随伴ウイルストランスダクションキット （品番：AAV-200）

※ここに掲載したプロトコールは、2013年4月現在のものです。実際にご使用される際には、キット及び試薬のプロトコールに準じて実験してください。

ViraBind™ AAV Purification Kit （品番：VPK-140）
【構成内容】
※ 本製品で精製できるセロタイプは、AAV2またはAAV-DJです。
1. ViraBind™ AAV Reagent A
2. ViraBind™ AAV Reagent B
3. AAV Purification Matrix
4. Purification Buffer
5. Elution Buffer
6. Centrifugal Concentrators

≪キットに含まれないもの≫
1. 15 mL コニカルチューブ
2. 遠心機 (10,000×g)

図1　測定原理

I. 精製
※下記の方法は、2.5mLのアデノ随伴ウイルス(AAV)上清の精製及び濃縮用に記載しています。
※ 2.5mLより少ないウイルス上清をご使用される場合は、血清フリーのDMEMを加え2.5mLに調製して下さい。
1. 25μLのViraBind™ AAV Reagent Aを2.5mLのウイルス上清に加えてよく混合します。
2. 37℃で30分間インキュベーションします。
3. AAV上清を15分間 5,000×gで遠心します。
4. 上清を注意深く回収し、新しいチューブに移します。ペレットは捨てます。
5. ViraBind™ AAV Reagent Bを30-60分間37℃で確実に溶かします。125 μLのViraBind™ AAV Reagent Bを4.のViraBind™ AAV Reagent Aで処理した2.5ｍＬのウイルス上清に加えてよく混合します。
6. 37℃で30分間インキュベートします。
7. 10,000×ｇ,10分間遠心し、AAVの上清を回収します。ペレットは捨てます。
8. AAVの上清を15mLのコニカルチューブに移します。
9. 遠心した上清に、300μLのAAV Purification Matrixを加え、ゆっくり混ぜます。
10. 上清とMatrixを混ぜ合わせた懸濁液を4℃、30分間オービタルシェーカーで混ぜます。
11. 1,000rpm,10分間遠心分離し、ペレットを得ます。
12. 注意深く、上清を除き、Purification Buffer 2.5mLで洗浄します。
13. 11-12のステップをもう一度行います。
14. 注意深く最後の洗浄液を除きます。
15. 0.5mLのElution Bufferを加え、Purification matrixから精製されたAAVを溶出します。
16. 4℃で10分間、オービタルシェーカーで混合します。
17. 溶出分画を集め、10分間1,000rpmで遠心します。
18. 注意深く上清を取り除きます。

II. バッファー置換と濃縮
1. 遠心型濃縮用チューブを通り組み立てます（図2）。
2. 0.5mLのリカバーしたAAVフラクション(上記ステップ18)を遠心型濃縮用チューブ内のsample reservoirにアプライします。濃縮用チューブを卓上型遠心機に入れ、2,000×gで5分間遠心します。フロースルーは廃棄します。
3. AAVフラクションを100μＬになるまでsample reservoir内で濃縮します。
4. 400μＬのPBSまたはご希望のバッファーを濃縮用チューブに加え、100μＬになるまで遠心します。4の操作をもう一度繰り返します。
5. ご希望の量まで濃縮します。
6. 新しいリカバリーチューブを用いて、濃縮されたサンプルを回収します。

図2　遠心型濃縮用チューブ