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セルバイオラボ社 アデノ随伴ウイルスによる遺伝子デリバリー

記事ID : 10866

3. アデノ随伴ウイルスの精製


※ここに掲載したプロトコールは、2013年4月現在のものです。実際にご使用される際には、キット及び試薬のプロトコールに準じて実験してください。

アデノウイルスの一般的なワークフロー

使用するキット及び試薬

ViraBind™ AAV Purification Kit (品番:VPK-140)
【構成内容】
※ 本製品で精製できるセロタイプは、AAV2またはAAV-DJです。
1. ViraBind™ AAV Reagent A
2. ViraBind™ AAV Reagent B
3. AAV Purification Matrix
4. Purification Buffer
5. Elution Buffer
6. Centrifugal Concentrators

≪キットに含まれないもの≫
1. 15 mL コニカルチューブ
2. 遠心機 (10,000×g)

測定原理
図1 測定原理

プロトコール

I. 精製
※下記の方法は、2.5mLのアデノ随伴ウイルス(AAV)上清の精製及び濃縮用に記載しています。
※ 2.5mLより少ないウイルス上清をご使用される場合は、血清フリーのDMEMを加え2.5mLに調製して下さい。
1. 25μLのViraBind™ AAV Reagent Aを2.5mLのウイルス上清に加えてよく混合します。
2. 37℃で30分間インキュベーションします。
3. AAV上清を15分間 5,000×gで遠心します。
4. 上清を注意深く回収し、新しいチューブに移します。ペレットは捨てます。
5. ViraBind™ AAV Reagent Bを30-60分間37℃で確実に溶かします。125 μLのViraBind™ AAV Reagent Bを4.のViraBind™ AAV Reagent Aで処理した2.5mLのウイルス上清に加えてよく混合します。
6. 37℃で30分間インキュベートします。
7. 10,000×g,10分間遠心し、AAVの上清を回収します。ペレットは捨てます。
8. AAVの上清を15mLのコニカルチューブに移します。
9. 遠心した上清に、300μLのAAV Purification Matrixを加え、ゆっくり混ぜます。
10. 上清とMatrixを混ぜ合わせた懸濁液を4℃、30分間オービタルシェーカーで混ぜます。
11. 1,000rpm,10分間遠心分離し、ペレットを得ます。
12. 注意深く、上清を除き、Purification Buffer 2.5mLで洗浄します。
13. 11-12のステップをもう一度行います。
14. 注意深く最後の洗浄液を除きます。
15. 0.5mLのElution Bufferを加え、Purification matrixから精製されたAAVを溶出します。
16. 4℃で10分間、オービタルシェーカーで混合します。
17. 溶出分画を集め、10分間1,000rpmで遠心します。
18. 注意深く上清を取り除きます。

 

II. バッファー置換と濃縮
1. 遠心型濃縮用チューブを通り組み立てます(図2)。
2. 0.5mLのリカバーしたAAVフラクション(上記ステップ18)を遠心型濃縮用チューブ内のsample reservoirにアプライします。濃縮用チューブを卓上型遠心機に入れ、2,000×gで5分間遠心します。フロースルーは廃棄します。
3. AAVフラクションを100μLになるまでsample reservoir内で濃縮します。
4. 400μLのPBSまたはご希望のバッファーを濃縮用チューブに加え、100μLになるまで遠心します。4の操作をもう一度繰り返します。
5. ご希望の量まで濃縮します。
6. 新しいリカバリーチューブを用いて、濃縮されたサンプルを回収します。

遠心型濃縮用チューブ
図2 遠心型濃縮用チューブ

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。


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