従来の Ca²⁺ プローブ Fluo-3、4 よりも高明度で早い！ カルシウム指示薬 Fluo-8®

Fluo-8® は、Fluo-3、Fluo-4 の便利な波長（最大励起波長 〜490 nm、最大蛍光波長 〜520 nm）は維持したまま、細胞ローディングやカルシウム応答を改善した Ca²⁺ 指示薬です。

Fluo-3 や Fluo-4 はよく使われている可視光励起のカルシウム指示薬です。しかし、Fluo-3 AM や Fluo-4 AM はエステラーゼ加水分解が行われる生細胞や、細胞内カルシウム応答を最大にするための細胞ローディングコンディションが厳しい生細胞では、蛍光は控えめになります。

Fluo-8® では、Fluo-3、Fluo-4 の便利な波長（最大励起波長 〜490 nm、最大蛍光波長 〜520 nm）は維持したまま、細胞ローディングやカルシウム応答を改善しています。細胞ローディングに、Fluo-3 AM、Fluo-4 AM では 37℃ でのインキュベーションが必要でしたが、Fluo-8® AM では室温でのインキュベーションで大丈夫です。さらに、Fluo-8® AM は Fluo-4 AM よりも2倍以上の、Fluo-3 AM よりも4倍以上の明るさを示します。

ABD社では、カルシウム結合親和性の異なる Fluo-8® 試薬をご用意しています。

• 明るいシグナル： Fluo-3 AM よりも4倍、Fluo-4 AM よりも2倍明るい
• 早いローディング： 室温、37℃ で 30分 〜 45分 で細胞に取り込まれます。
• 便利： 励起 490 nm ＆ 蛍光 520 nm（FITCフィルターセット適合）

図1　Fluo-8® AM と Fluo-4 AM を用いた HEK293 細胞のカルバコール応答性
HEK-293 細胞を、96ウェルプレート（Costar black wall/clear bottom）に 40,000細胞/100 µL/ウェル の濃度で播種し、一晩培養した。培養培地を除去後、Fluo-4 AM、Fluo-8 AM を溶解した色素ローディング溶液 100 µL を添加し、室温で1時間インキュベートした。カルバコール（25µL/ウェル）を最終表示濃度になるように NOVOstar で加えた。蛍光シグナルは Ex/Em=490/525 nm で測定した。Fluo-8® で測定したカルバコールの EC50 は約 1.2 µM であった。

Fluo-3 AM

Fluo-4 AM

Fluo-8 AM

図2
U2OS 細胞を、96ウェルプレート（Costar black wall/clear bottom）に 40,000細胞/100µL/ウェル の濃度で播種し、一晩培養した。培養培地を除去後、HHBS に溶解した 4 µM の Fluo-3 AM、Fluo-4 AM、Fluo-8 AM を添加し、37℃で1時間インキュベートした。 HHBS（200 µL）で2回洗浄後、FITC チャンネルを用いた蛍光顕微鏡で観察した。

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