商品情報

記事ID : 32934
研究用

最高輝度を誇るカルシウムインジケーターカルシウム指示薬 Calbryte™ シリーズ

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使用目的

Calbryte™ シリーズは、細胞内カルシウムをモニターするために開発された蛍光色素ファミリーで、緑色、赤色、深赤色蛍光を示す3種類を、AMフォーム (生細胞中のアッセイに適した細胞透過性タイプ) 、塩フォーム (生細胞や組織へのマイクロインジェクションに適したタイプ) で提供しています。蛍光顕微鏡、蛍光マイクロプレートリーダー、フローサイトメトリーで測定が可能です。

Ca2+インジケーター Excitation (nm) Emission (nm) Kd (µM)
Calbryte™ 520 492 514 1.2
Calbryte™ 590 580 592 1.4
Calbryte™ 630 608 624 1.2

特長

    既存のカルシウムインジケーター (Fluo-3 AM、Fluo-4 AM、Rhod-2 AM) と比較して、

  • より高輝度
  • より改善されたシグナルノイズ比
  • より簡単な細胞ローディング
  • より長い細胞内滞留

使用例

CHO-K1 細胞の ATP 応答
※クリックで再生します

図1. Fluo-4 AM (左) とClbryte™ 520 AM (右) を使ったCHO-K1 細胞の ATP 応答
CHO-K1 細胞を一晩培養し、50,000 細胞/100 µL/ウェルになるよう 96ウェルプレートに播種した。Calbryte™溶液 (プロベネシド入りHHバッファーにCalbryte™ (10 µg/ml) を100 µL添加) もしくは Fluo-4 溶液 (プロベネシド入りHHバッファーに Fluo-4 (10 µ/mL) を100 µL添加) を加え、37℃、45分間インキュベートした。色素溶液を除去した後、200 µL HHバッファー/ウェルで置換し、ATP (50 µL/ウェル) を再終濃度10 µMになるように加えた。その後、蛍光顕微鏡 (Keyence、FITCチャンネル) 下で観察した。

 

レセプターのATP応答の図

図2. CHO-K1 細胞における内因性 P2Y レセプターのATP応答
CHO-K1 細胞を一晩培養し、40,000細胞/100 µL/ウェルになるよう96ウェルプレートに播種した。Calbryte™溶液 (プロベネシド入りHHバッファーにCalbryte™ (10 micro;g/mL) を100 µL添加) を加え、37℃、1時間インキュベートした。色素溶液を除去した後、200 µL HHBSを加え、50 µM ATP (50 µL/ウェル) を加えた。その後、蛍光顕微鏡 (Keyence、FITCチャンネル/TRITCチャンネル/Texsas Red® チャンネル) 下で観察した。

 

Calbryte520 AM vs Fluo4 AMの図

図3. Calbryte™ 520 AM vs Fluo4 AM
カルバコールの用量反応を、Calbryte™ 520 AM および Fluo-4 AM を用いて CHO-K1 細胞で測定した。 CHO-K1 細胞を、50,000細胞/100µL/ウェル (96ウェル黒色壁、透明底 Costar プレート) で一晩培養した。HHバッファーに Calbryte™ 520 AM (10 µg/ mL) または HHバッファーに Fluo-4 (10 µg/ mL) を 100 µL添加し、37℃で45分間インキュベートした。色素ロ溶液を除去し、200 µLのHHバッファー/ウェルで置換し、カルバコール (50 µL/ウェル) を FlexStaion 3 で表記濃度になるまで添加した。

 

商品リスト

■ 緑色:Calbryte™ 520

1989年にFluo-3が紹介されて以降、シグナル/バックグラウンド比が改善されたFluo-4、Fluo-8、およびCal-250®が開発され、共焦点顕微鏡、フローサイトメトリ、およびハイスループットスクリーニングアプリケーションにおいてCa2+指示薬として広範に使用されてきました。しかし、Fluo-4にはいくつかの深刻な問題があります。例えば、Fluo-4 AMを使用したほとんどの細胞内カルシウムアッセイでFluo-4の細胞外漏出を防ぐためにプロベネシドを添加する必要があります。プロベネシドは様々な細胞への影響をもつことが知られており、プロベネシドを使用してFluo-4 を基盤としたカルシウムアッセイを行うことでアッセイ結果に問題が生ずる可能性があります。 Calbryte™ 520 AMは新規の蛍光かつ細胞透過性カルシウム指示薬で、他のAM色素の細胞導入と同様に、Calbryte™ 520 AMエステルは非蛍光ですが、細胞に入ると細胞内エステラーゼによる加水分解を受けて活性化されます。活性化された指示薬は極性分子となり細胞膜を自由に透過できなくなり、主に細胞内に蓄積されます。Calbryte™ 520は、Ca2+イオンに結合すると非常に高いシグナル/バックグラウンド比をもつ明るい蛍光シグナルを産生します。さらに、Calbryte™ 520は細胞内保持率が著しく改善されています。Fluo-4と同一の励起と発光波長をもつため、Fluo-4アッセイ設定と同じ設定をそのままCalbryte™ 520を利用するカルシウムアッセイに利用できます。Calbryte™ 520は、細胞内カルシウム測定用の次世代型蛍光指示薬で、シグナル/バックグラウンド比と細胞内保持特性が非常に改善されていることから、生細胞内におけるGPCR やカルシウムチャネル標的の評価を始め、そのアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングに適しています。

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図.4 CHO-K1細胞における内在性P2Y受容体のATP応答
CHO-K1細胞を96穴の黒壁/澄明底コースタープレートの各ウェルに40,000細胞/100 µLずつ播種して一晩培養した。プロベネシドを添加したFluo-4 AM (Cat# 20551) またはCal-520® AM (Cat# 20651) のHHBS溶液を100 µLずつ細胞に添加し、37℃で45分間培養した。色素導入溶液を200 µL HHBSと置換し、50 µLの50 µM ATPを添加した。細胞は蛍光顕微鏡(Keyence)のFITCチャネルを用いてイメージングした。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
CalbryteTM 520 AM詳細データ ABD 20650 2*50 UG
¥20,000
CalbryteTM 520 AM詳細データ ABD 20651 10*50 UG
¥62,000
CalbryteTM 520 AM詳細データ ABD 20653 1 MG
¥83,000
CalbryteTM 520, potassium salt詳細データ ABD 20656 2*50 UG
¥41,000
CalbryteTM 520, potassium salt詳細データ ABD 20658 10*50 UG
¥87,000

■ 赤色:Calbryte™ 590

Calbryte™ 590は、Calcium Orange™ や Rhod-2といったAAT Bioquest社の橙赤蛍光指示薬の性能を高めたものです。この色素の最大励起波長は580 nmであり、555 nmレーザー線で良好に励起します。最大発光波長は592 nmであり、TRITC/Cy3®フィルターセットと互換性があります。Calbryte™ 590は、同様条件下でRhod-2に比べてカルシウムに対しおよそ10倍高感度です。さらに、ミトコンドリアに主に局在するPhod-2と異なりCalbryte™ 590は細胞基質に良好に保持されます。

【Calbryte™ 590 AMの主な特長】

  • GFPに対応する赤方偏移カルシウム指示薬
  • Calcium Orange™ や Rhod-2の優れた代替品
  • Rhod-2に比べて10倍高感度
  • Rhod-2や Cal-590™ に比べて細胞内のシグナル/バックグラウンド比が大きく改善
  • 細胞内保持が著しく亢進
  • 細胞基質に均一に局在
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図.5 CHO-K1細胞における内在性P2Y受容体のATP応答
CHO-K細胞を96穴の黒壁/透明底コースタープレートの各ウェルに40,000細胞/100 µLずつ播種して一晩培養した。2 mM プロベネシドとHHBSに溶解したCalbryte™ 590 AM (Cat# 20701) を100 µL細胞に添加し、37℃で1時間培養した。その後、色素導入溶液を200 µL HHBSと置換した。細胞は50 µLの50 µM ATPを添加前後において、蛍光顕微鏡(Keyence)のTRITCチャネルを用いて画像化した。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
CalbryteTM 590 AM詳細データ ABD 20700 2*50 UG
¥41,000
CalbryteTM 590 AM詳細データ ABD 20701 10*50 UG
¥83,000
CalbryteTM 590 AM詳細データ ABD 20702 1 MG
¥125,000
CalbryteTM 590, potassium salt詳細データ ABD 20706 5*50 UG
¥62,000

■ 深赤色:Calbryte™ 630

Calbryte™ 630は、X-Rhod-1といった赤&深紅蛍光指示薬の性能を高めたものです。この色素は最大励起波長608nmをもち、594nmレーザー線と良好に一列に並びます。この色素の最大八稿波長は624nmであり、一般的なTexas® Redフィルターセットと互換性があります。スペクトルの緑色領域と離れているため、Calbryte™ 630は iFluor™ 488、Alexa Fluor® 488、またはGFPといった緑色蛍光標識とのマルチプレックスに適しています。さらに、Calbryte™ 630は長波長の発光であるため、組織深層部の研究に適しています。これは波長が長い色素ほど数々の細胞層を浸透しやすく、短波長色素では浸透しにくいためです。

【Calbryte™ 630 AMの主な特長】

  • GFPに対応する赤方偏移カルシウム指示薬
  • X-Rhod-1 や Cal-630™の優れた代替品
  • 細胞内保持が著しく亢進
  • iFluor™ 488、Alexa Fluor® 488、またはGFP等の緑色蛍光標識とのマルチプレックスに最適
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図.6 CHO-K1細胞における内在性P2Y受容体のATP応答
CHO-K細胞を96穴の黒壁/透明底コースタープレートの各ウェルに40,000細胞/100 µLずつ播種して一晩培養した。細胞に、2 mM プロベネシドとHHBSに溶解したCalbryte™ 630 AM (Cat# 20721)を100 µL添加し、37℃で1時間培養した。その後、色素導入溶液を200 µL HHBSで置換した。細胞に50 µLの50 µM ATPを添加した後、蛍光顕微鏡(Keyence)のTexas Red®チャネルを用いて画像化した。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
CalbryteTM 630 AM詳細データ ABD 20720 2*50 UG
¥41,000
CalbryteTM 630 AM詳細データ ABD 20721 10*50 UG
¥83,000
CalbryteTM 630 AM詳細データ ABD 20722 1 MG
¥146,000
CalbryteTM 630, potassium salt詳細データ ABD 20727 5*50 UG
¥62,000

AAT Bioquest 社カルシウム指示薬製品一覧

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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