サポート情報

技術情報

Cytodiagnostics社 金ナノ粒子・金コロイドの基礎と応用

記事ID : 14548
研究用

クエン酸安定化金ナノ粒子へのタンパク質コンジュゲート方法

6. 金ナノ粒子へのタンパク質標識法 ‐ 受動吸着


金ナノ粒子コンジュゲートは、光学顕微鏡および電子顕微鏡観察におけるプローブとして使用されるなど、生物学的アプリケーションで幅広く利用されています。

安定した金ナノ粒子コンジュゲートは、タンパク質と金コロイドの表面層間で生じる静電相互作用と疎水性相互作用に基づく受動吸着によって容易に調製することができます。受動吸着のプロセスは、タンパク質の等電点(pI)付近の pH で最大の効率を示します。

金ナノ粒子コンジュゲートを調製する時に考慮すべき重要なパラメーターは、金コロイドに結合したタンパク質の量です。金表面に吸着されるタンパク質があまりにも少量の場合、標準的なバッファー中に存在する電解質の添加時に、凝集が起こります。したがって、コロイドの安定性とタンパク質が飽和濃度に達したかどうかを決定するための滴定が実施されます。

材料および必要な機器

  • スタンダード金ナノ粒子
  • 10% (w/v) NaCl
  • 10% (w/v) PEG (5,000-20,000Da)
  • 1X Phosphate Buffered Saline, PBS
  • 標識するタンパク質(Protein to be conjugated)
  • UV-VIS Spectrophotometer

滴定(Titration)の手順

本手順では、金コロイドを飽和させ安定化させるために必要なタンパク質の量を決定します。

  1. 再懸濁した金ナノ粒子 250μl を1.5mlのエッペンドルフチューブに移します。
  2. 金コロイドのpHを、標識するタンパク質の等電点(pI)と一致するように調整します。
  3. タンパク質溶液(0〜1mg のタンパク質含有)25 μl を金ナノ粒子に添加し、金表面を飽和させるのに必要なタンパク質量を滴定します。
  4. 室温で10〜15分間インキュベートします。
  5. 10%のNaCl溶液250μlを添加します。
  6. 色の変化を観察し、金ナノ粒子表面が飽和し10%NaClを添加しても凝集が生じないタンパク質濃度を決定します。コントロールと比較したときに、580nm 吸光度の増大によって観測できます。

Note:金コロイドを飽和させるのに必要なタンパク質の量は、金ナノ粒子表面へのタンパク質の結合で電荷が変化するため、アガロースゲル電気泳動でも決定することができます。

金ナノ粒子コンジュゲートの調製

  1. 各アプリケーションに必要な量の金ナノ粒子を、新しいチューブに分注します。
  2. 上記で決定した必要タンパク質量+10% を添加します。
  3. 攪拌しながら室温で30分間インキュベートします。
  4. 使用する金ナノ粒子のサイズに適した速度で30分間溶液を遠心します。
    (→ 金ナノ粒子の適切な遠心速度については 金ナノ粒子:保管と取り扱いを参照ください。
  5. 0.1%BSAまたは1% PEGを含むPBSを添加して、ペレットを再懸濁します。
  6. 使用するまで4℃で保管します。
pagetop

 

関連製品情報ページ

参考文献

Thobhani, S., Atree, S., Boyd, R., Kumarswami, N., Noble, J., Szymanski, M., Porter, R.A. (2010) Bioconjugation and characterization of gold colloid-labelled proteins Journal of Immunological Methods 356, 60-69

お問い合わせ

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。


メーカー・代理店一覧

サポート情報

SNSアカウント

© COSMO BIO