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研究用

特集:アデノ随伴ウイルス(AAV)による遺伝子導入方法

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アデノ随伴ウイルス(AAV)は、アデノウイルスやレトロウイルスに比べ、宿主細胞への免疫反応が低いため、遺伝子導入実験で注目を集めています。

コスモ・バイオでは、アデノ随伴ウイルス(AAV)実験を強力にサポートする、一連のウイルス発現・パッケージング・トランスダクション試薬を販売しております。また、プリメイド粒子やAAV作製受託サービスも取り扱っております。

背景

アデノ随伴ウイルス(AAV)について

In vitro およびin vivo における遺伝子・タンパク質の機能や調節機構を研究する上で重要な手法が遺伝子導入法です。

遺伝子導入法には、1.非ウイルスベクター系と2.ウイルスベクター系の2つに大きく分けられます。ウイルスベクター系には、レトロウイルスやレンチウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターを用いた方法などが含まれ、非ウイルスベクター系には、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法など物理化学的方法を用いた方法が含まれます。

ここでは、アデノ随伴ウイルス AAVを用いた遺伝子導入法についてご紹介します。アデノ随伴ウイルスは、分裂/ 非分裂細胞の両方に感染することができ、人の宿主細胞で維持され、持続性のある遺伝子導入が可能です。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスやレトロウイルスに比べ、宿主細胞への免疫反応が低いため、遺伝子導入実験用途で注目を集めています。

一般的なウイルス遺伝子デリバリーのワークフロー

一般的なウイルス遺伝子デリバリーのワークフロー ターゲット細胞への感染 濃縮および精製 タイター測定 ウイルスのパッケージング

セルバイオラボ社ではパッケージングからトランスダクションまでAAV 発現に必要な試薬をトータルに取りそろえています。ワークローに沿って商品をご紹介いたします。

セルバイオラボ社のAAV ヘルパーフリー発現システムは、リコンビナントAAV ウイルス粒子をヘルパーウイルスなしで作製するシステムです。感染性AAV 粒子の作製に必要なアデノウイルス遺伝子はpHelper プラスミド(E2A、E4、VA RNA 遺伝子等)上にあり、ヒトAAV ベクターDNA と共トランスフェクションされます。E1 遺伝子は293 宿主細胞で恒常的に発現しています。native AAV セロタイプ1 〜 6 に加えて、新規セロタイプDJ およびDJ/8 を調製できます。

Step 2: ウイルスのパッケージング

AAV ヘルパーフリー発現システム AAV ヘルパーフリー発現システム

ヘルパーウイルスを使用しない新しいAAV発現システム

 AAV ヘルパーフリー発現システム(プロモーターレス)

AAV ヘルパーフリー発現システムに、プロモーターレス商品が加わりました。プロモーターレス発現ベクターは、マルチクローニングサイト(MCS)を有し、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等をクローニングできます。

 scAAV ヘルパーフリー発現システム

scAAV(自己相補的なAAV)は、一方のITR(Inverted Terminal repeats)でDシーケンス(パッケージングシグナル)が欠損し、terminal resolution siteのミューテーション(Δtrs)が含まれます。これらがRepを介したニッキングを防ぎ、ダイマーまたはゲノムの自己パッケージングを招きます。scAAVベクターからdsAAVを作製することで、in vivoin vitro の実験の両方において、形質導入の効率が大幅に改善されます。

 アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター&ウイルス粒子

ヒト/マウス/ラット遺伝子を組み込んだプリメイドAAVベクターパッケージング済みAAV粒子を幅広く取り揃えており、プロモーターおよび蛍光レポーター(ルシフェラーゼ/GFP)をお選びいただけます。

 組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)作製受託サービス 受託サービス

【GeneDetect 社】
目的の遺伝子をpAAVプラスミドにクローニングし、AAVにパッケージングするサービスです。国内外に多数実績があります。

 アデノ随伴ウイルス(AAV)作製受託サービス 受託サービス

【SignaGen 社】
SignaGen 社は独自の技術で非常に高い感染性の rAAV 粒子(通常の rAAV の約 30 倍の感染性)を超高タイター(1 x 1015 GC)で調製可能な下記の受託サービスをご用意しております。

Step 3: タイター測定

 QuickTiter™ アデノ随伴ウイルス定量キット

一般的に、AAVウイルス粒子はDNAドットブロットや類似の方法で定量しますが、これらの方法は時間がかかるなど難点がありました。 QuickTiter™ AAV定量キットはAAVプレップの核酸含有量を定量するキットで、わずか2時間で未精製のAAV-2セロタイプや精製AAV-1、AAV-2、AAV- 5の力価を定量可能です。

Step 4: 濃縮および精製

ViraBind(TM) アデノ随伴ウイルス精製キット ViraBind™ アデノ随伴ウイルス精製キット

一般的には塩化セシウム密度差平衡勾配遠心で精製されますが、時間がかかる上、回収率や品質が悪く、ウイルス以外のタンパク質の混入が大きな問題となっています。ViraBind™ AAV 精製キットは独自のマトリックスを利用したワンステップカラムを使ってわずか3 時間で簡単にウイルス上清から高純度のアデノ随伴ウイルス(AAV-2 とAAV-DJ)を精製できます。

 OptiPrep™ アデノ随伴ウイルス精製プロトコール

OptiPrep™ は密度媒体 Iodixanol の水溶液(滅菌済)です。多用途の遠心分離溶液で、目的に応じて濃度調整をして使用できます。アデノ随伴ウイルス精製のプロトコールをご紹介します。

Step 5: ターゲット細胞への感染

ViraDuctin(TM) AAV 遺伝子導入キット ViraDuctin™ AAV 遺伝子導入キット

AAVを用いた遺伝子導入の効率は、宿主細胞に依存します。感染率はS期細胞で最も高くなりますが、S期細胞は細胞集団としてはごくわずかです。

ViraDuctin™ AAV遺伝子導入試薬では、分裂細胞、非分裂細胞ともにAAVベクターの導入効率を著しく増加させることができます。

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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