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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12454
研究用

1. 細胞及び組織のライセート調製


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

■ 培養細胞

1. 遠心分離機を予め4℃に冷却しておきます。培養細胞のペレットを4℃、1000 x g(約2000rpm)で5分間遠心します。氷冷した1 x PBSで3回洗浄し、冷却したRIPAバッファー(プロテアーゼ阻害剤入り)を加えます。通常は、ペレット106細胞当たり、RIPAバッファー100μLを加えます(遠心の前に細胞をカウントします)。より高いタンパク質濃度が必要な場合は、RIPAバッファーの容量を適宜減らしてください。ボルテックスして混合し、30分間氷上に保存します(時々ボルテックスしてください)。ステップ3に進みます。

 

■ 組織

2. 対象の組織を解剖し、血液の除去が必要な場合は冷却した1 x PBSで短く洗浄します。氷上で冷やしつつ、組織を小片にカットします。組織をホモジェナイザーにいれ、RIPAバッファー(プロテアーゼ阻害剤入り)を加えます。通常は、組織約10mgあたり、RIPAバッファー500μLを加えます。完全にホモジェナイズし、サンプルを30分間氷上に保存します(時々ボルテックスしてください)。ステップ3に進みます。

Top tip 1:
リン酸化タンパク質の抽出の場合は、溶解バッファーにホスファターゼ阻害剤を加えます。

 

■ 溶解及び保存

3. サンプルを超音波処理し、細胞又は組織を更に破壊し、DNAを切断します。サンプルに応じて超音波処理時間を調節してください。180ワットの出力で、細胞ライセートは1分間、組織ライセートは2-5分間(10秒超音波/10秒静止を1サイクルとして繰り返します)が目安です。超音波処理中サンプルは氷冷してください。

Top tip 2:
DNA分解のためのDNaseの添加は、酵素からタンパク質が汚染する可能性があるため、推奨しません。

4. 10,000 x g(半径9.5cmのローターで約9700rpm)、4℃で20分間遠心し、細胞の破片を沈殿させ、ペレットに触れないように、上清を新しいマイクロチューブに移します。

5. Bradford又はBCAタンパク質アッセイで、ライセートのタンパク質濃度を算出します。

6. サンプルは-80℃で長期間保存可能です。すぐにウェスタンブロットや免疫沈降に使用することもできます。

7. ウェスタンブロットの場合は、サンプルに4X SDSサンプルバッファーを最終濃度が1Xになるように加え、混合します。SDS-PAGEゲルにロードする前に、混合液を95℃で5分間加熱します。

 

■ バッファー

1 X PBS 1000 mL
10mM Na2HPO4 1.42 g
1.8 mM NaH2PO4 0.22 g
140 mM NaCl 8.19 g
Adjust pH to 7.4
Add ddH2O to 1000 mL
RIPA溶解バッファー 1000 mL
50 mM Tris•HCl, pH 7.4 50 mL
150 mM NaCl 8.76 g
1% Triton X-100 or NP-40 10 mL
0.5% デオキシコール酸ナトリウム 5 g
0.1 % SDS 1 g
1 mM EDTA (0.5 M stock) 2 mL
10 mM NaF 0.42 g
Add ddH2O to 1000 mL
使用する直前に1mMになるようにPMSF及びその他のプロテアーゼ阻害剤を加える
4X SDSサンプルバッファー 1000 mL
12% SDS 120 g
25% Glycerol 250 mL
150 mM Tris•HCl (pH 7.0•1M stock) 150 mL
0.05% Bromophenol Blue 5 g
6% β-mercaptoethanol 60 mL
Add ddH2O to 50 mL, aliquot and store at -20°C

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