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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12460
研究用

4. 培養細胞の免疫蛍光染色


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

本プロトコールの全てのステップは、特に記載がない限り、室温で実施してください。最適な染色結果を得るため、インキュベーションは、ロータリーシェーカーでゆっくり揺らしながら実施してください(神経細胞などの繊細な細胞株は除く)。

 

■ 固定及び透過処理

1. 培地を吸引し、播種したカバーガラス上の細胞を、すばやく1X PBSで洗浄します。

2. 細胞を、新しく1X PBSで調製した4%ホルムアルデヒドで10分間固定します。カバーガラスを1X PBSで3回(各3分間)洗浄します。

3. 1X PBSで調製した0.2% Triton X-100で5分間透過処理します。カバーガラスを1X PBSで3回(各3分間)洗浄します。

 

■ ブロッキング

4. 正常血清に5%濃度になるように、1X PBSを加え、ブロッキング溶液を調製します。血清は、二次抗体の免疫動物種由来のものを選択してください。例えば、二次抗体がヤギ抗マウス抗体の場合は、ヤギ血清を選択します。細胞をブロッキング溶液で1時間インキュベートします(対応する血清が入手できない場合は、1%BSAを含む1X PBSを使用します)。

 

■ 抗体のインキュベーション

5. ブロッキング溶液を吸引し、抗体希釈バッファーで希釈した一次抗体を加えます。カバーガラスのうち1枚は、ネガティブコントロールとして、一次抗体を加えずに抗体希釈バッファーのみでインキュベートします。室温で1時間又は4℃でオーバーナイトインキュベートします(オーバーナイトの場合は、カバーガラスが乾かないように注意してください)。

6. カバーガラスを1X PBSで3回(各3分間)洗浄します。

7. 抗体希釈バッファーで希釈した適切な蛍光標識二次抗体をカバーガラスに加え、湿った暗所で1時間インキュベートします(蛍光試薬を添加した後は、できる限り暗い場所に置くようにしてください)

8. カバーガラスを1X PBSで3回(各3分間)洗浄します。

 

■ 封入及び観察

9. カバーガラスをHydromount (National Diagnostics(NDS)社製、品番:HS-106)で顕微鏡スライドに封入します。核染色が必要な場合は封入剤にDAPIを加えてください。

10. 蛍光顕微鏡でスライドを観察します。

 

■ バッファー

1X PBS 1000 mL
10 mM Na2HPO4 1.42 g
1.8 mM NaH2PO4 0.24 g
140 mM NaCl 8.18 g
2.68mM KCl 0.20 g
Adjust pH to 7.4
Add ddH2O to 1000 mL
抗体希釈バッファー 20 mL
1% BSA 0.2 g
Add 1X PBS to 20mL

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