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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12458
研究用

3. ウェスタンブロット


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

本プロトコールの全てのステップは、特に記載がない限り、室温で実施してください。

 

■ SDS-PAGE

1. SDS-PAGEゲルをターゲットタンパク質の分子量(MW)に応じて構成します(推奨のゲル処方は下記参照)。

Top tip 1:
トリス-トリシンゲルは、トリス-グリシンゲルより低い分子量のタンパク質(<20kDa)を分離します。

Top tip 2:
濃度勾配ポリアクリルアミドゲルは、シャープなバンドが得られ、1つのゲル上で広範囲の分子量サイズ(10-500kDa)を分離できます。

2. サンプルをマイクロチューブに準備します。1サンプル当たりのトータルタンパク質量が30-50μgになるように、4X SDSサンプルバッファーを加えます(タンパク質量は、Bradford又はBCAタンパク質アッセイで測定してください)。

3. マイクロチューブを軽くはじいて混合し、95-100℃で5分間加熱します。

4. 電気泳動装置をセットアップし、1×泳動バッファーに浸します。ゲルのくしを取り除き、濃縮ゲルのウェルを洗浄します。

5. サンプル及びタンパク質マーカーを、ローディングチップを使ってゲルにロードします。電気泳動パワーパックを80V(濃縮ゲル全体)にセットし、泳動タンパク質の先端が分離ゲルに達したら120Vに上げます。

Top tip 3:
最初の実験ではサンプル量を多くし、ターゲットシグナルを確認したあと、適宜調節してください。

 

■ タンパク質転写

6. PVDF膜(又はターゲットの分子量が30kDa未満の場合は、微小孔が0.22μmのPSQ膜)を推奨します。膜をメタノールに30秒間浸し、転移バッファーに移します。ろ紙及びスポンジも同様に転移バッファーに移します。

7. 下図に従って順番にスポンジ、ろ紙、ゲル、膜を、気泡が入らないように、重ねます。メーカーの取り扱い説明書に従って、セミドライ転写システム又はウェット転写システムにかけます。

転写「サンドイッチ」の構成図

図1 転写「サンドイッチ」の構成図
ゲルと膜の方向が非常に重要です。PVDF膜がプラス電極に近い方になるようにセットしてください。アミノ酸は負に荷電しており、タンパク質はプラス極に向かって移動します。

Top tip 4:
ターゲットの分子量が100kDaより高い場合、セミドライ転写システムの代わりにウェット転写システムを4℃でオーバーナイト使用することを提案します。更に、ウェット転写バッファーに0.1% SDSを添加することで、転写しやすくなります。

Top tip 5:
2mLのstripetteを「めん棒」としてとして使用し、「サンドイッチ」上を回転させることで、生じてしまった気泡を除去することができます。

 

■ イムノブロッティング

8. 転写後膜を蒸留水で2回洗浄し、膜に鉛筆でMWラダーのバンドの印をつけます。必要な場合は、膜を市販のPonceau red溶液で1分間染色し、タンパク質のバンドを可視化します(その後大量の1X TBSTでPonceau red染色を洗い流してください)。

9. 脱脂粉乳(2-5%)(又は、リン酸化エピトープ抗体の検出の場合は、1-5%BSA)を含む1X TBSTでブロッキングし、4℃で1時間又はオーバーナイト一定に揺らしながらインキュベートします。

10. 一次抗体をブロッキング溶液で希釈します(1:1000倍希釈からスタートし、最適な希釈倍数を予備実験で決定してください)。膜を、ベンチトップのローター上で、一次抗体と4℃で1時間又はオーバーナイトインキュベートします。

11. 膜を1X TBSTで3回(各10分間)洗浄します。

12. 膜を対応するHRP標識二次抗体(一次抗体の免疫動物種を認識する抗体)とインキュベートします(二次抗体はブロッキング溶液で1:5000-1:50000の範囲で希釈してください)。一定に揺らしながら1時間インキュベートします。

13. 膜を1X TBSTで3回(各10分間)洗浄します。

Top tip 5:
ブロッティングの工程では膜を乾燥させないでください。

Top tip 6:
一次抗体溶液の長時間インキュベートには、抗体希釈バッファーに0.2% NaN3を添加することができます。
ご注意:二次抗体溶液には適用できません。

■ シグナル検出

14. メーカーの取り扱い説明書に従って、ECL基質を調製します。

15. 膜を基質と1-5分間インキュベートします(より感度の高いECL基質(例:SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate [Pierce]など)の場合はインキュベート時間は適宜調節してください)。

16. 膜を暗室でオートラジオグラフィーフィルムに暴露するか、又は化学発光映像システムを用いて読み取ります。

Top tip 7:
最適な露光時間を決定するために、複数の露光時間で露光してください。ブロットフィルムの方向をマークするには、蛍光マーカーを使用します。

17. 発色したフィルムは、正しいブロット方向に並べ、分子量ラダーのバンドをフィルムに直接マークします。レーン内容、露光時間、ECL特性などもメモしておくとよいでしょう。

 

■ バッファー

4X SDSサンプルバッファー 50 mL
150 mM Tris•HCl (pH 7.0)
(1M stock)
7.5 mL
25% glycerol 12.5 mL
12% SDS 6.0 g
0.02% Bromophenol Blue 10 mg
5% β-mercaptoethanol 3.0 mL
Add ddH2O to 50mL, aliquot and store at -20°C.
1X TBSTバッファー 1000 mL
20 mM Tris-base 2.42 g
150 mM NaCl 8.76 g
50 mM KCl 3.73 g
0.2% Tween-20 2 mL
Adjust pH to 7.6
Add ddH2O to 1000mL
ウェット転写バッファー 1000 mL
25 mM Tris-base 3.03 g
192 mM Glycine 14.4 g
20% Methanol 200 mL
Add ddH2O to 1000 mL
セミドライ転写バッファー 1000 mL
48 mM Tris-base 5.81 g
39 mM Glycine 2.93 g
0.0375% SDS 0.375 g
20% Methanol 200 mL
Add ddH2O to 1000 mL

 

■ SDS-PAGEゲル調整

ターゲットタンパク質の分子量が20から200kDaの範囲の場合は、下表に従って、通常のSDS-PAGEゲルを作製します。分離が必要なターゲットタンパク質の分子量に従って、ゲルの%を選択してください。

   分離ゲル
(mL、トータル10mL)
濃縮ゲル(mL)
4mL 6mL 8mL
ターゲットタンパク質の分子量(kDa) 80-200 35-100 25-60 20-40
ゲル% 8% 10% 12% 15% 4%
ddH2O 4.6 4.0 3.3 2.3 2.9 4.3 5.7
30%アクリルアミド 2.7 3.3 4 5 0.5 0.8 1.1
分離/濃縮バッファー 2.5 2.5 2.5 2.5 0.5 0.8 1
10% APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.04 0.06 0.08
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.004 0.006 0.008

4x 分離バッファー(250 mL)
1.5M Tris HCl (pH 8.8), 0.4% SDS
トリス46.75gをddH2O 100mLに溶解し、濃縮HClでpHを8.8に調整し、SDS 1gを加えてよく溶かします。ddH2Oを加えて最終容量を250mLにします。

4x 濃縮バッファー(250 mL)
1.0 M Tris HCl (pH6.8), 0.1% SDS
トリス15.13gをddH2O 100mLに溶解し、濃縮HClでpHを6.8に調整し、SDS 0.25gを加えてよく溶かします。ddH2Oを加えて最終容量を250mLにします。

1X 泳動バッファー 1000 mL
25 mM Tris-base 3.03 g
192 mM Glycine 14.4 g
0.1% SDS 1.0 g
Add ddH2O to 1000 mL
pH 8.3

■ トリシンゲル調整

ターゲットタンパク質の分子量が20kDaより小さい場合、より高い解像度が得られるためトリシンゲルシステムを推奨します。下表及び図に従って、トリシンゲルを3層作製して配置してください。トリシンゲル泳動バッファーを泳動システムに添加して通常通り電気泳動を実施してください。

  分離層(6mL) 中間層(3mL) 濃縮層(2mL)
ゲル% 15% 10% 4%
38% グリセロール 1.6 - -
ddH2O - 1.2 1.4
30% アクリルアミド 2.7 0.8 0.3
分離/濃縮バッファー 2.14 1 0.3
10% APS 0.06 0.03 0.02
TEMED 0.003 0.003 0.002

1x トリシンゲル分離バッファー(250 mL)
3 M Tris HCl (pH 8.5), 0.1% SDS
トリス93.5gをddH2O 150-200mLに溶解し、濃縮HClでpHを8.5に調整し、SDS 0.25gを加えてよく溶かします。ddH2Oを加えて最終容量を250mLにします。

1x トリシンゲル濃縮バッファー(250 mL)
1 M Tris HCl (pH6.8), 0.1% SDS
トリス15.13gをddH2O 100mLに溶解し、濃縮HClでpHを6.8に調整し、SDS 0.25gを加えてよく溶かします。ddH2Oを加えて最終容量を250mLにします。

PGI_Protocol_3_2.jpg

図2 トリシンゲルのゲル層構成図

トリシンゲル泳動バッファー 1000 mL
100 mM Tris-base 12.1 g
100 mM Tricine 17.9 g
0.1% SDS 1 g
Add ddH2O to 1000 mL
セミドライ転写バッファー
(20kDaより小さいタンパク質の場合)
1000 mL
3M Tris 363 g
1.1M Acetic acid (CH3COOH) 66 g
Add ddH2O to 1000 mL
pH 8.3

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