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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12457
研究用

2. 封入体からのタンパク質精製


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

1. 細胞ペレット(培養1Lから)をPBSTバッファー30-35mLに懸濁します。

2. 細胞をアイスバス中で6分間超音波処理(200W)します。

3. 細胞ライセートを、4℃、8000rpmで、約13分間遠心し、上清を捨てます。

4. ペレットをTNMFX-2M 尿素バッファー5mLに再懸濁し、10mLの遠心管に移します。

5. 溶液をアイスバス中で1分間超音波処理(200W)します。

6. さらにTNMFX-2M 尿素バッファー5mLを遠心管に加え、4℃で30分間ローター上で回転させます。

7. 4℃、4000rpmで20分間遠心し、上清を捨てます。

8. ステップ4-7を繰り返します。

9. ペレットをTNMFX-0.1% Triton-X100 5mLに再懸濁します。

10. 溶液をアイスバス中で1分間超音波処理(200W)します。

11. さらにTNMFX-0.1% Triton-X100 5mLを遠心管に加え、4℃で30分間ローター上で回転させます。

12. 4℃、4000rpmで20分間遠心し、上清を捨てます。

13. ステップ9-12を繰り返します。

14. ペレットに2倍容量のdH2Oを加え、ボルテックスして洗浄します。1000rpmで2分間遠心します。上清が澄明になるまで洗浄を繰り返します。ペレットを回収します。

15. 実施するアプリケーションに応じてタンパク質を希釈します。a)免疫化には、1.5倍容量の8M尿素(pH 8)、b)抗体精製には、2倍容量の2%サルコシル添加PBSを加え4℃でオーバーナイトインキュベートします。1000rpmで7分間遠心し、上清を回収します。

 

■ バッファー

TNMFX-2M 尿素バッファー 1000mL
50mM Tris-base 6.06g
150mM NaCl 8.77g
1mM EDTA 0.37g
2M Urea 120.20g
Add ddH2O to 1000 mL
Adjust to pH 8.0
PBSTバッファー 1000mL
58mM Na2HPO4 8.24g
17mM NaH2PO4 2.04g
68mM NaCl 3.98g
1%Triton-X100 10mL
Add ddH2O to 1000 mL
Adjust to pH 7.4
TNMFX-0.1% Triton X100 1000mL
50mM Tris 6.06g
150mM NaCl 8.8g
1mM EDTA 0.4g
0.1% Triton-X100 1mL
Add ddH2O to 1000 mL
Adjust to pH 8.0
2%サルコシル添加PBS 200mL
58mM Na2HPO4 1.65g
17mM NaH2PO4 0.41g
68mM NaCl 0.80g
2% Sarkosyl 4.00g
Add ddH2O to 200 mL
Adjust to pH 8.0
8M 尿素バッファー 200mL
Urea 96.08g
Add ddH2O to 200mL
Adjust to pH 8.0

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