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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12466
研究用

8. 間接ELISA


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

本プロトコールの全てのステップは、特に記載がない限り、室温で実施してください。

 

■ 抗原のコーティング

1. 精製抗原を最終濃度0.2μg/mLになるように、抗原コートバッファーで希釈し、その100μLを96ウェルELISAプレートの各ウェルに加えます。

2. プレートを慎重に接着性プラスチックでカバーし、4℃でオーバーナイトインキュベートします。

 

■ ブロッキング

3. ウェルの抗原コートバッファーを除去し、PBSTバッファー200μLで2回(各5分間)洗浄します。

4. 1つのウェルにつき、ブロッキングバッファー200μLを加え、残ったタンパク質結合サイトをブロッキングします。接着性プラスチックでプレートをカバーし、1〜2時間 37℃でインキュベートします。

 

■ 抗体のインキュベーション

5. 一次抗体をブロッキングバッファーで段階希釈します(1:500、1:1000、1:2000、1:4000など)。ウェル中のブロッキングバッファーを除去し、1つのウェルにつき各抗体希釈液を100μL加えます。正確さを確認するため、反復2回又は3回操作します。接着性プラスチックでプレートをカバーし、37℃で1時間インキュベートします。

6. 抗体希釈液を除去し、PBSTバッファー 200μLで3回(各5分間)洗浄します。

7. HRP標識二次抗体をブロッキングバッファーで最適濃度に希釈(希釈倍数は、1:10,000-1:100,000の範囲を推奨します)し、各ウェルに二次抗体希釈液を100μLずつ加えます。接着性プラスチックでプレートをカバーし、37℃で1時間インキュベートします。

8. 二次抗体希釈液を除去し、PBSTバッファー 200μLで3回(各5分間)洗浄します。

 

■ シグナル検出

9. TMB基質(TMBバッファーA及びバッファーBを等量混合する)100μLを、マルチチャネルピペットで各ウェルに加えます。15分後発色がピークに達したら、1ウェル当たり2M H2SO4 100μLを加え、反応を止めます。450nmにおける吸収を測定します。

 

■ バッファー

抗原コートバッファー 1000 mL
100 mM NaHCO3 8.4 g
Adjust pH to 9.6
Add ddH2O to 1000 mL
PBSTバッファー 1000 mL
10 mM Na2HPO4 1.42 g
1.8 mM NaH2PO4 0.22 g
140 mM NaCl 8.19 g
0.2 % Tween 20 2 mL
Adjust pH to 7.4
Add ddH2O to 1000 mL
ブロッキングバッファー 100 mL
5%脱脂粉乳 5 g
Add PBST buffer to 100 mL
TMB基質バッファーA 500 mL
酢酸ナトリウム・3H2O 13.6 g
クエン酸 1.6 g
30% H2O2 0.3 mL
Add ddH2O to 500 mL
TMB基質バッファーB 500 mL
TMB (DMSO 3mLに溶かす) 0.15 g
EDTA-2Na 0.2 g
クエン酸 0.95 g
Glycerol 50 mL
Add ddH2O to 500 mL

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