技術情報

Proteintech（PGI）社　プロトコール

記事ID ： 12466

8. 間接ELISA

メーカー名：Proteintech Group, Inc.

Proteintech（PGI）社商品　FAQ・トラブルシューティング

商品詳細「プロテインテック（Proteintech）社抗体のご紹介」

本プロトコールの全てのステップは、特に記載がない限り、室温で実施してください。

■ 抗原のコーティング

1. 精製抗原を最終濃度0.2μg/mLになるように、抗原コートバッファーで希釈し、その100μLを96ウェルELISAプレートの各ウェルに加えます。

2. プレートを慎重に接着性プラスチックでカバーし、4℃でオーバーナイトインキュベートします。

■ ブロッキング

3. ウェルの抗原コートバッファーを除去し、PBSTバッファー200μLで2回（各5分間）洗浄します。

4. 1つのウェルにつき、ブロッキングバッファー200μLを加え、残ったタンパク質結合サイトをブロッキングします。接着性プラスチックでプレートをカバーし、1～2時間 37℃でインキュベートします。

■ 抗体のインキュベーション

5. 一次抗体をブロッキングバッファーで段階希釈します（1：500、1：1000、1：2000、1：4000など）。ウェル中のブロッキングバッファーを除去し、1つのウェルにつき各抗体希釈液を100μL加えます。正確さを確認するため、反復2回又は3回操作します。接着性プラスチックでプレートをカバーし、37℃で1時間インキュベートします。

6. 抗体希釈液を除去し、PBSTバッファー 200μLで3回（各5分間）洗浄します。

7. HRP標識二次抗体をブロッキングバッファーで最適濃度に希釈（希釈倍数は、1：10,000-1：100,000の範囲を推奨します）し、各ウェルに二次抗体希釈液を100μLずつ加えます。接着性プラスチックでプレートをカバーし、37℃で1時間インキュベートします。

8. 二次抗体希釈液を除去し、PBSTバッファー 200μLで3回（各5分間）洗浄します。

■ シグナル検出

9. TMB基質（TMBバッファーA及びバッファーBを等量混合する）100μLを、マルチチャネルピペットで各ウェルに加えます。15分後発色がピークに達したら、1ウェル当たり2M H₂SO₄ 100μLを加え、反応を止めます。450nmにおける吸収を測定します。

■ バッファー

抗原コートバッファー	1000 mL
100 mM NaHCO₃	8.4 g
Adjust pH to 9.6
Add ddH₂O to 1000 mL

PBSTバッファー	1000 mL
10 mM Na₂HPO₄	1.42 g
1.8 mM NaH₂PO₄	0.22 g
140 mM NaCl	8.19 g
0.2 % Tween 20	2 mL
Adjust pH to 7.4
Add ddH₂O to 1000 mL