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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12464
研究用

6. 免疫沈降


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 商品詳細 「Protein A(HRP標識) 」

 

各ステップの操作を氷上又は4℃のコールドルームで行い、できる限りサンプルの冷却状態を保ってください。

 

■ サンプル調製

使用する細胞組織サンプルの種類に対応した細胞溶解プロトコールを用いて細胞を溶解します。
プロテインテック社推奨の溶解プロトコールは、「1. 細胞及び組織のライセート調製」をご参照ください。

Top tip 1:
高濃度の界面活性剤は免疫沈降(IP)に干渉作用があります。できる限り少量のRIPA溶解バッファーで細胞を溶解してから、1x PBSでライセートを必要量まで希釈してください。

Top tip 2:
十分な量のライセートを使用してください。IPには、1-3mgのトータルタンパク質を用います。0.2-0.5mLのライセート(1-3mgのトータルタンパク質を含む)が、1回のIPに理想的な量です。Bradford又はBCAアッセイのようなタンパク質アッセイでトータルタンパク質を測定してください。

Top tip 3:
ライセートバッファーにプロテアーゼ阻害剤が含まれていることを確認してください。プロテアーゼ阻害剤の濃度は、ウェスタンブロット用のライセート調製時より1.5-2倍必要です。

 

■ ライセートのプレ洗浄(オプション)

1. プロテインA又はGセファロースビーズ懸濁液の保存容器を穏やかにボルテックスし、再懸濁します。ライセートを含むマイクロチューブに、トータルタンパク質0.5-1mgにつき50%ビーズ懸濁液50μLをすばやく加えます。

Top tip 4:
ビーズ懸濁液をピペッティングしやすいように、ピペットチップの先端を45°の角度でカットします。吸引力を維持するために、ピペットチップ先端のほんの少しだけを切り取るようにしてください。

2. 4℃で30分間ロータリー上でインキュベートして混合します。

3. 4℃、1000rpmで3分間遠心し、上清を新しいチューブに移します。

Top tip 5:
プロテインA又はGセファロースによるプレ洗浄は、IgGの多い組織の場合に推奨します。

4. 適切な量の一次抗体(1-4μg)をライセート全体(又はプレ洗浄したライセート)に加えます。最適な抗体濃度は、力価から決定してください。ネガティブコントロールとして、コントロールIgG(一次抗体由来に対応する)で同様に操作します。4℃で2-4時間又はオーバーナイト穏やかに揺らしながらインキュベートします。

5. プロテインA又はGセファロースビーズ懸濁液50μLを加え、免疫複合体を捕捉します。混合液を4℃で1-4時間穏やかに揺らしながらインキュベートします。

6. IP混合液を4℃、1000rpmで30秒間遠心し、上清を捨てます。

7. RIPA溶解バッファー 1mL又は 0.2% Tween 20を含む1X PBS 1mLでビーズを洗浄し、ステップ6と同様に遠心して上清を捨てます。

Top tip 6:
過剰な量のプロテインA又はGセファロースビーズ懸濁液を使用しないでください。ウェスタンブロットで、プロテインA又はGが非特異的にIgGと結合し、非特異的バンドの原因となります。

 

■ 溶出

8. ペレットを、500mM NaClを含む150mM グリシン-HCl(pH1.5-2.5)溶液バッファー40μLで2回溶出します。溶出液を合わせ、アルカリ中和バッファー(1.7M NaOH)10μL、または 10X PBSバッファーを最終濃度が1Xになるように加えて中和します。

9. 溶出液に5X SDSサンプルバッファーを加え、95℃で5分間加熱します。

Top tip 7:
溶出バッファー中の塩濃度を上げると、タンパク質が溶出しやすくなります。

 

■ ウェスタンブロット解析

10. 10,000x g(半径9.5cmのローターで、約9700rpm)で3分間遠心します。上清をSDS-PAGEゲルにロードします。あるいは、上清を新しいマイクロチューブに移し、使用するまで-80℃で保管します。

11. SDS-PAGEでIPを分離し、PVDF膜にタンパク質を転写します。適切な抗体でプローブします。

Top tip 8:
免疫沈降したタンパク質を、ウェスタンブロットで検出する際、非特異的な結果(免疫沈降に使用した抗体の重鎖及び軽鎖など)を検出しないために、従来のHRP標識二次抗体の変わりに、HRP標識プロテインA(品番SA00001-18)で、一次抗体を検出します(プロテインAは、活性のある完全な抗体にのみ結合しますが、免疫沈降に使用した抗体は、ステップ10で不活性化され、変性されています)。

 

■ バッファー

RIPA溶解バッファー 1000 mL
50 mM TrisHCl, pH 7.4
(1 M stock)
50 mL
150 mM NaCl 8.76 g
1% Triton X-100 10 mL
0.5% デオキシコール酸ナトリウム 5 g
0.1 % SDS 1 g
10 mM NaF 0.41 g
1 mM EDTA (0.5 M stock) 2 mL
Add ddH2O to 1000 mL
Adjust to pH 7.4
使用する直前に1mMになるようにPMSF及びその他のプロテアーゼ阻害剤を加える
5X SDSサンプルバッファー 50 mL
250 mM Tris HCl (pH 7.0)
(1M stock)
12.5 mL
35% Glycerol 17.5 mL
10% SDS 5 g
0.02% Bromophenol Blue 10 mg
10% β-mercaptoethanol 4.0 mL
Add ddH2O to 50mL, aliquot and store at -20°C.

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