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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12469
研究用

11. 可溶性Hisタグタンパク質のアフィニティ精製


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

I. 細胞の溶解

1. 細胞を、His洗浄バッファー30-35mLに懸濁します。

2. アイスバス中で、細胞を6分間超音波処理(200W)します。

3. ライセート溶液をローター上で、4℃で1時間回転させます。

4. 細胞ライセートを4℃、8000rpmで約13分間遠心分離します。

 

II. タンパク質のビーズ結合

1. 上清をHis-ビーズ600μLに移します。

2. 混合液をローター上で、4℃でオーバーナイト回転させます。

3. 4℃、2000rpmで5分間遠心し、ビーズを回収します。タンパク質が結合したビーズをエッペンドルフチューブに回収します。

 

III. 未結合タンパク質の洗浄

1. ビーズをHis洗浄バッファー1mLで3回洗浄し、上清を捨てます。

 

IV. ビーズからタンパク質を溶出

1. ビーズにHis溶出バッファー300μLを加えます。

2. 混合液をローター上で、4℃で1時間回転させます。

3. 2000rpmで1分間遠心し、上清を回収します。

4. ステップIVの1〜3を繰り返します。

5. 溶出液を合わせます(トータル600μL)。

6. SDS-PAGE分析で分子量及び純度を確認します。

 

バッファー

His洗浄バッファー 1000mL
20mM Imidazole 1.36g
1x PBS buffer 1000mL
Adjust to pH 7.0
1x PBS buffer 1000mL
58mM Na2HPO4 8.24g
17mM NaH2PO4 2.04g
68mM NaCl 3.98g
Add ddH2O to 1000 mL
Adjust to pH 7.4
His溶出バッファー 1000mL
300mM Imidazole 20.42g
10% Glycerol 100mL
1x PBS buffer 900mL
Adjust to pH 7.0

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