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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12462
研究用

5. パラフィン包埋組織切片の免疫組織染色


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

本プロトコールの全てのステップは、特に記載がない限り、室温で実施してください。

 

■ 脱パラフィン及び再水和

1. スライドをキシレンに10分間浸漬します。新しいキシレンで再度10分間浸漬します(必要に応じて更に新しいキシレンで3回目の浸漬を行ってください)。

2. 切片を100%、95%、80%、60%メタノールに順番にそれぞれ5分間浸漬し、再水和します。

3. 切片を蒸留水で3回(各3分間)洗浄します。

 

■ 抗原賦活化(オプション)

4. スライドを電子レンジ耐性容器に入れ、クエン酸バッファーでカバーします。

5. 中程度の出力で、電子レンジで10分間加熱します。

6. スライドをクエン酸バッファー中で約35分間冷却します。

 

■ 一次抗体のインキュベーション

7. スライドを1X TBSで3回(各3分間)洗浄します。

8. スライドを、3%H2O2溶液(蒸留水で希釈)で、10分間インキュベートし、内在性のペルオキシダーゼ活性を阻害します。

9. スライドを1X TBSで3回(各3分間)洗浄します。

10. ブロッキング用の正常血清を5%濃度になるように1X TBSで調製します。血清は、二次抗体の免疫動物種由来のものを選択してください。切片を1時間ブロッキングします(対応する血清が入手できない場合は、5%BSAを含む1X PBSを使用します)。

11. 切片を1X TBSで希釈した一次抗体と、室温で1時間又は4℃でオーバーナイトインキュベートします。最適な抗体の希釈倍率は、予備実験で決定してください。ネガティブコントロールとして、各実験条件につき1枚のスライドを一次抗体インキュベートから除外します。

12. 一次抗体インキュベート後、スライドを1X TBSで3回(各分間)洗浄します。

 

■ シグナル検出

(プロテインテック社では、通常このステップではEnVisionキット(Dako社製)を使用しています)

13. 十分な量のペルオキシダーゼ標識ポリマーを加え、30分間インキュベートします。

14. スライドを1X TBSで3回(各3分間)洗浄します。

15. 使用の直前に、基質バッファー1mLにDAB及びクロモゲン溶液1滴を加え、基質溶液を調製します。基質溶液を加え、5-10分間茶色に発色するまでインキュベートします。

16. 切片を十分な量の蒸留水で洗浄します。

 

■ ヘマトキシリンカウンター染色(オプション)

17. 核染色する場合は、スライドをヘマトキシリンに3分間浸漬します。

18. スライドを蒸留水で穏やかに洗浄します。

19. スライドを 1% HCl, 99% エタノール溶液に10秒間漬け、すぐに蒸留水に移します。

 

■ 脱水及び封入

20. スライドを60%、80%、90%、100%エタノールに順番にそれぞれ5分間浸漬します。

21. スライドをキシレンに10分間浸漬します。新しいキシレンで再度10分間浸漬します。

22. 十分な量の封入剤で切片を封入し、カバーガラスをかけます。換気の良い場所(ドラフトなど)で乾燥させます。

 

■ バッファー

クエン酸バッファー 1000 mL
10mM トリス-クエン酸ナトリウム・2H2O 2.9 g
1.9mM クエン酸・H2O 0.4 g 
Adjust pH to 6.0
Add ddH2O to 1000 mL
1X TBSバッファー 1000 mL
20 mM Tris-base 2.4 g
150 mM NaCl 8.7 g
Adjust pH to 7.6
Add ddH2O to 1000 mL

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