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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12468
研究用

10. 可溶性GSTタグタンパク質のアフィニティ精製


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

I. 細胞の溶解

1. 細胞ペレットを、10mM PMSF及び0.5M EDTAを添加したグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)洗浄バッファー30-35mLに懸濁します。

2. アイスバス中で、細胞を6分間超音波処理(200W)します。

3. ライセート溶液をローター上で、4℃で1時間回転させます。

4. 細胞ライセートを4℃、8000rpmで約13分間遠心分離します。

 

II. タンパク質のビーズ結合

1. 上清をGST-ビーズ600μLに移します。

2. 混合液をローター上で、4℃でオーバーナイト回転させます。

3. 4℃、2000rpmで5分間遠心し、ビーズを回収します。タンパク質が結合したビーズをエッペンドルフチューブに回収します。

 

III. 未結合タンパク質の洗浄

1. ビーズをGST洗浄バッファー1mLで3回洗浄し、上清を捨てます。

 

IV. ビーズからタンパク質を溶出

1. ビーズにGST溶出バッファー300μLを加えます。

2. 混合液をローター上で、4℃で1時間回転させます。

3. 2000rpmで1分間遠心し、上清を回収します。

4. ステップIVの1〜3を繰り返します。

5. 溶出液を合わせます(トータル600μL)。

6. SDS-PAGE分析で分子量及び純度を確認します。

 

バッファー

GST洗浄バッファー(PBSTバッファー) 1000mL
58mM Na2HPO4 8.24g
17mM NaH2PO4 2.04g
68mM NaCl 3.98g
1% Triton X-100 10mL
Add ddH2O to 1000 mL
Adjust to pH 7.4
GST溶出バッファー 1000mL
100mM GSH 30.70g
10% Glycerol 100mL
1x PBST buffer 900mL
Adjust to pH 8.0

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