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Proteintech(PGI)社 プロトコール

記事ID : 12467
研究用

9. タンパク質結合セファロースによる抗体のアフィニティ精製


 Proteintech(PGI)社商品 FAQ・トラブルシューティング

 商品詳細 「プロテインテック(Proteintech)社抗体のご紹介」

 

I. アフィニティマトリクス及びタンパク質結合セファロースマトリクスの調製

a) カップリングバッファー中の融合タンパク質1mgを、4℃でオーバーナイト透析します。

b) タンパク質のカップリングに必要な臭化シアン(CNBr)活性化セファロース4Bの量を計算します。通常は、1gのCNBrが3.5mLのセファロースビーズを活性化し、1mLの活性化セファロースは、5-10mgのタンパク質に吸着します。

c) 冷HCl 20-50mL中で、4℃で15分間セファロースビーズを活性化します。

d) ビーズを1mM HClで洗浄します。一般的に1gのセファロースビーズの洗浄にはHCl 200mLが必要です。

e) 適切な量の活性化セファロースビーズを透析した融合タンパク質と共に、室温で2時間、又は4℃でオーバーナイトインキュベートします。

f) タンパク質が結合したセファロースマトリクスを、カップリングバッファー15mLで洗浄します。

g) ビーズの未結合部位をブロックするため、1M トリス-HClバッファー(pH 8)3mLを加え、室温で2時間又は4℃でオーバーナイトインキュベートします。

 

II. タンパク質結合セファロースによる抗血清の精製

a) 適切な量のタンパク質結合セファロースビーズを、PBSバッファーで3回洗浄します。

b) ビーズを、血清と共に、室温で3時間又は4℃でオーバーナイトインキュベートします。

c) 精製カラムのフロースルーを回収し、ELISA試験用に保管します。

d) ビーズを、PBSバッファー10mLで3回洗浄します。

e) カラムを150mM NaCl-HCl(pH 5)溶液10mLで洗浄します。

f) 溶出バッファー6mLで抗体を溶出させ、飽和リン酸バッファーで溶液を中和します。通常は、溶出バッファー1mLに対し、飽和リン酸バッファー50-100μLが必要です(温度による)。

g) 抗体溶液は、短期間であれば4℃で保存できます。長期間の保存の場合は、0.02% アジ化ナトリウムを添加した50%グリセロール溶液中で、-20℃で保存してください。

 

III. ビーズの洗浄及びリサイクル

a) ビーズを、0.01M トリス-HCl(pH7.5)バッファー15mLで3回洗浄します。

b) ビーズを、PBSバッファー10mLで3回洗浄します。

c) ビーズに、0.02% アジ化ナトリウムを含む1mL グリセロールとPBS 1mLを加え、次に使用するまで4℃に保管します。

 

バッファー

カップリングバッファー 1000mL
100mM NaHCO3 8.40g
500mM NaCl 29.2g
Add ddH2O to 1000mL
Adjust to pH 8.3
PBSバッファー 1000mL
10mM Na2HPO4 1.42g
1.8mM NaH2PO4 0.22g
140mM NaCl 8.19g
Add ddH2O to 1000mL
Adjust to pH 7.4
溶出バッファー 1000mL
150mM NaCl 8.8g
Add ddH2O to 1000mL
Use HCl to adjust to pH 2.5
飽和リン酸バッファー
PBSバッファーにNa2HPO4を飽和するまで加える

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