サポート情報

技術情報

酪農食品科学特論 - 機能性ミルクタンパク質実験講座 - 改訂版

記事ID : 13234

I.構造編-13.立体構造の測定法


タンパク質の立体構造とは

すでに述べましたが、タンパク質のアミノ酸配列を一次構造(primary structure)といい、各ペプチド主鎖がどのような構造をとっているかを二次構造(secondary structure)といいます。すなわち、αヘリックス、β構造、βターンの規則性(繰り返し)のある構造と不規則構造です。これらがドメインと呼ばれるペプチド鎖の折りたたみ構造を形成し、タンパク質の分子全体の構造をとります。この時、ドメインよりさらに大きなローブ(lobe)構造をとって分子構造を形成する場合もあります。これを三次構造といいます。さらに、タンパク質分子が複数の会合体を形成して機能を発揮する場合があり、それを四次構造あるいはサブユニット構造といいます。これらタンパク質の高次構造はその一次構造によって規定されていると信じて差し支え無いでしょう。

 

 

タンパク質の未変性・変性状態

いわゆる未変性(native)の状態にあるタンパク質から、SDSや尿素などの変性剤、あるいはpHや温度条件によってその状態が変化することを変性(denaturation)といいます。ある場合にはこの変化は可逆的であり、そのような時にもとの状態にもどることを再生あるいは巻き戻し(renaturationあるいはrefolding)といいます。変性のメカニズムを知ることによって、逆にタンパク質の折りたたみに関する情報が得られる可能性があります。また、フォールディング(折りたたみ、folding)とは細胞内でタンパク質が生合成された場合に、ペプチド主鎖を折りたたんで構造をとることをいいます。タンパク質が立体構造をとる時、まず最初に二次構造の骨組みが出来てからその後に三次構造が形成されるというフレームワークモデルが提案され、この中間の状態をモルテングロビュール(molten globule)構造とよんでいます。変性の時にはこの逆の過程、すなわち未変性状態から中間状態を経て変性状態になると考えられています。

 

 

二次構造含量を推定する実験方法

タンパク質の二次構造を推定するには、過去には旋光分散(ORD)測定が用いられていましたが、その後はもっぱら円偏光二色性(CD)スペクトル測定が用いられました。その他に赤外線スペクトル測定も有効です。また、タンパク質の三次構造の決定にはX線結晶構造解析が用いられ、ペプチドや比較的分子量の小さいタンパク質の場合には核磁気共鳴(NMR)による解析が有効です。これらについては第15章を参照して下さい。


図13-1.高次構造の明らかな15種類のタンパク質から導かれた二次構造のCDスペクトル1)

 

 

CDスペクトルによる二次構造の推定

CDスペクトルの測定によって二次構造を推定することができるのは、αヘリックス、β構造、不規則構造のそれぞれで紫外部領域でのスペクトルパターンとCD強度が異なるからです。合成ポリアミノ酸であるポリ-L-グルタミン酸あるいはポリ-L-リジンなどでは、pHを変えたり、加熱することにより二次構造が変わります。それらのCDスペクトルでは、αヘリックスの場合に208-209, 222 nmに負の極大、191-193 nmに正の極大、β構造では216-218 nmに負の極大、195-200 nmに正の極大、不規則構造では195-200 nmに負の極大が観察されています2)

モデルペプチドではなく、実際に高次構造が知られている15種のタンパク質からαヘリックス、β構造、βターン、不規則構造にそれぞれ固有のCDスペクトルを求め(図13‐1)、その値を用いて対象タンパク質のCDスペクトルに最もよく適合する構造の組合せを求める方法もあります。この方法を用いてウシラクトフェリンの紫外部でのCDスペクトル(図13-2)から二次構造のそれぞれの含量を計算しました。その結果、ウシラクトフェリンでは、αヘリックス 12%、β構造 37%、βターン 16%、不規則構造 34%と算定されました3)

紫外部のCDスペクトル測定によって二次構造を推定する方法は、高分解能NMRやX線結晶構造解析に比べて少ない労力で測定・解析が出来るうえ、比較的に測定操作も簡便です。そのため、詳細な構造データが得られていないタンパク質の構造予測に関する情報を提供するうえで有効な方法です。なお、タンパク質は揺らいだ動的な構造をもつことが知られていますが、ほとんどの場合、溶液中と結晶での構造は同じと考えられています。また、赤外線領域(波数1600-1700 cm-1)でのCDスペクトルは二次構造によるパターンがそれぞれ著しく異なるために、より詳しい情報が得られ、非常に有効と考えられています。


図13-2.ウシラクトフェリンのCDスペクトルの一例。左右で縦軸のスケールが違うことに注意。溶媒は0.05 M リン酸緩衝液 (pH 6.2)。日本分光(JASCO)model J-500で測定。)

 

 

アミノ酸側鎖由来のCDスペクトル

250-300 nmの波長範囲で測定されるCDスペクトル(図12-2の右側)は、アミノ酸残基の芳香族側鎖に起因するもので、ポリペプチド主鎖の構造変化が生じていない場合でもより鋭敏に変化を検出できます。たとえば温度やpHの変化、変性剤添加、リガンドの結合などによって生ずる芳香族基の周辺の微細な環境変化が観察できます。これらは二次構造の変化を伴なわない微妙な変化に対応して検出されるため、ストップトフロー(stopped-flow)法やpHジャンプ(pH-jump)法を用いたタンパク質の構造形成の中間状態の研究、組換えタンパク質がもともとのタンパク質とどのように異なるかの比較などにも活用されています。また、発色団すなわち芳香族基による誘起CDスペクトルの測定をした例として、ブルー色素(Cibacron Blue F3GA)とラクトフェリンの相互作用を可視領域での誘起CDスペクトルから測定し、ウシとヒトとで色素との結合様式に違いがあることを検出できました4)(第2編、リガンドとの相互作用の章を参照)。

 

 

赤外スペクトルによる二次構造の推定

タンパク質の赤外線吸収スペクトルでは、波数(波長の逆数で表し、単位はcm-1)が1500〜1700の範囲にペプチド結合に特異的な吸収帯があり、特にアミド I (1600-1700 cm-1)、アミド II (1500-1550 cm-1)と呼ばれる振動帯が二次構造の推定に用いられています。これはアミノ酸残基が分子鎖に組み込まれた構造をとることで、各原子間の運動(伸縮、振動、回転)が変化し、吸収帯のシフトとして観測されるためです。αヘリックスでは1650 cm-1 と1546 cm-1 に、平行β構造では1630 cm-1 と1530 cm-1 に、逆平行β構造では1632 cm-1 と1530 cm-1 に、不規則コイルでは1655 cm-1 と1535 cm-1 に主な吸収が観察されます。すなわち吸収の生じた波長(波数)から分子の運動(振動数)の解析ができる訳です。

これらの波長領域では水の吸収が大きいため、溶媒には重水(D2O)を用います。一方、CDスペクトル測定とは違って、粉末やフィルム状の試料も測定できます。なお、赤外線吸収スペクトルでは時々刻々と変わる分子構造をピコ秒刻みで追跡することも可能です。

 

 

ラマン分光による二次構造の推定

タンパク質溶液に振動数ν0のレーザー光を当て散乱光を測定した場合に、ν0 ± νi に観察される弱い散乱光をラマン散乱といいます。このようなタンパク質のラマン分光では、アミド I 、II、III の振動数で二次構造が分かり、S-SやC-S伸縮振動数でCys架橋やMet側鎖の構造、TyrやTrpのラマン線からそれらの環境や水素結合の有無を推定することが出来ます。また、励起させるレーザー光の波長を分子の吸収帯に近づけると、その吸収帯を与える発色団のラマン散乱が非常に強くなる現象があります。これを共鳴ラマン散乱といいます。

アミド II 領域の赤外線吸収スペクトルやラマン分光あるいはNMR化学シフト法では、CDスペクトル測定よりも高濃度の試料が必要です。この場合、タンパク質同士の会合の影響がでることがあります。これらの要因のために、分光学的な方法によって推定される二次構造含量の精度には限界があります。

補足

a) 構造(structure, conformation)、二次構造(secondary structure)、三次構造(tertiary structure)、四次構造(quarternary structure)、折りたたみ構造(folding)、規則構造(ordered structure)、不規則構造(unordered structure, random coil)、未変性状態の(native)、変性(denaturation, unfolding)、再生(renaturation, refloding)

b) 二次構造の種類については第13章の補足aを参照して下さい。なおβストランド(β-strand)とはβ構造の中の一本のポリペプチド鎖のことをいいます。何本か集まってβ構造をとります。

c) 旋光分散 (optical rotatory dispersion, ORD)、円偏光二色性スペクトル(あるいは円二色性スペクトル、circular dichroic spectrum, CD spectrum)、赤外線スペクトル (infrared spectrum)、核磁気共鳴 (nuclear magnetic resonance, NMR)。

d) ORDで二次構造を求めるには波長範囲300〜600 nmでの旋光分散値を用いてMoffitt-Yangの式から算出しましたが、この方法は右巻きへリックスと不規則構造しか存在しない場合に有効でした5)

e) 円偏光二色性スペクトルはモル円二色性(Δε)、あるいはモル楕円率([θ])で表示され、[θ] = 3300Δεの関係があります。

f) 吸収スペクトルの各ピークが何に由来するものかを決めることを、帰属を決定するといいます。

g) 現在はフーリエ変換赤外分光器(FT-IR)という方式が主流です。

h) 散乱光を測定する場合は、入射光に対して直角の角度で測定します。

i) ラマン散乱では赤外吸収とは異なり、アミド II は弱く観察されます。

参考図書

1) Yang,J.T., et al. Methods in Enzymology vol.130, Enzyme Structure Part K 208-269 (1986)
(CD測定データから二次構造を算出するプログラムリストあり)
2) Greenfield,N. & Fasman,G.D. Biochemistry, 8, 4108-4116 (1969)
3) Shimazaki,K., et al.,Comp. Biochem. Physiol., 98B, 417-422 (1991)
4) Shimazaki,K., et al.,Comp. Biochem. Physiol., 101B, 541-545 (1992)
5) 浜口浩三・武貞啓子「生物化学実験法C蛋白質研究法4蛋白質の旋光性―CDとORD―」東京大学出版会(1971)

「新生化学実験講座1タンパク質-III 高次構造」日本生化学会編、東京化学同人、45-53 (CD), 53-65 (赤外、ラマン)(1990)
「基礎生化学実験法・第3巻タンパク質 I 検出・構造解析法」日本生化学会編、東京化学同人,227-238(2001)
萩原義久「円偏光二色性(CD)を利用した蛋白質の熱変性測定」Jasco Report 49(2) 30-33 (2007)
濱口浩三「改訂蛋白質機能の分子論」学会出版センター(1990)
Krimm,S. & Bandekar,J. “Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins” in Advances in Protein Chemistry, 38, 181-364 (1986)
Woody,R.W.,「蛋白質の円二色性−解析と理論に関する最近の発展−」蛋白質・核酸・酵素41巻1号56-69 (1996)
Yang,J.T.,「蛋白質の2次構造と光学活性」蛋白質・核酸・酵素39巻14号2275-2283、16号2814-2819 (1994)

問題

問1.旋光性および円偏光二色性(あるいは円二色性)とは光のどのような性質ですか。また、旋光度の測定値の単位は何ですか。

問2.溶液中でタンパク質が二次構造・三次構造を安定に保つために、どのような作用が働いていますか。

問3.一般に遠紫外、近紫外、可視、遠赤外、近赤外領域とはどの範囲の波長領域を指しますか。また、X線ではどうでしょうか。

問4.アミド吸収帯を波数ではなく波長で表示するとどのようになりますか。なお、振動数(ν) = C×(波数)の関係があります。Cは光の速度です。

問5.赤外吸収や紫外吸収の場合、光の透過度はランベルト・ベールの法則(Lambert-Beer’s law)に従います。この法則はどのようなものですか。

提供:北海道大学名誉教授 島崎 敬一

(2014年7月 改訂)

  • カタログ請求
  • お問い合わせ

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。


商品検索

商品情報

サポート情報

メーカー・代理店一覧

企業情報

関連サイト


© COSMO BIO