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酪農食品科学特論 - 機能性ミルクタンパク質実験講座 - 改訂版

記事ID : 13235

I.構造編-14.分子モデリングの実際


タンパク質の立体構造を見るために

タンパク質の原子座標データと表示用のソフトウエアがあれば、タンパク質の形すなわち立体的な構造をパーソナルコンピュータの画面上に表示して、かつ様々な操作をすることができます。目的タンパク質の立体構造データの検索をし、目的のタンパク質のX線結晶構造解析による座標データを入手するためには、立体構造データベースであるRCSBのProtein Data Base (PDB)にアクセスします。ここで得られる立体構造データ形式は、Brookhaven PDB フォーマットといわれる形式です。ここではPDB IDが不明の場合はタンパク質名で検索が行えます。lactoferrinと入力した場合の画面を図14-1に示します。非常に多くのデータがヒットするので、さらに絞り込みを行わなければなりません。目的のpdbデータが見つかったならばダウンロードし、分子モデル表示のためのソフトウエアにこのデータを読み込ませることとなります。

milk_protein_14_1.jpg

図14-1. RCSB PDBのトップサイトで検索欄にlactoferrinと入力した画面。ウシラクトフェリンならばBos taurusを選択する。X線結晶解析によるデータ、あるいはNMRデータの選択もこの画面で行える。

 

 

立体構造 表示ソフトウエア

分子構造を表示するソフトウェアは有料のものから無料で使えるもの、Windows、iOS (Mac)、Linuxさらには各種タブレットやスマートフォンで動作するものまで見つかります。本講座では個人で気軽に使えるフリーソフトの使用を前提とします。なお、各ソフトウエアによって表現が異なることがありますが、針金モデル (wireframe)、骨格モデル (backborn)、空間充填モデル(spacefill)、リボンモデル(ribbons) シリンダーモデル (cylinders)などでタンパク質の立体構造を表示することができ、かつ自由に分子を回転させたり、あるいは分子内の任意の部分を色分けして表示することも出来ます。さらに一部を空間充填モデルで表示し、他の部分をリボンモデルなどという異なるモデルによる組み合せでの表示も可能です。

milk_protein_14_2.jpg

図14-2. 3種類のソフトウエアでウシラクトフェリン分子 (1BLF.pdb)1)を表示した。黄色で識別した部分はNローブに見いだされた抗菌性ペプチドのラクトフェリシンで、2個の●(赤丸)は鉄イオン。用いたソフトウエアは(A) RasMol(PICT形式で保存した後にjpeg形式に変換、貼付け)、(B) VMD(スクリーンショットを直に貼付け)、(C) CMol (iPad、スクリーンショットに保存し、パソコンに送ったpng形式のファイルを貼付け)で、RasMolとCMolではcartoon、VMDはnew cartoonで表示した。

 

 

X線結晶構造解析

X線結晶構造解析では、タンパク質分子が規則正しく並んだ結晶(単結晶)にX線を照射して得られる回析X線の測定強度から、フーリエ変換で結晶中の電子密度分布を求め、さらに重原子(Hg, Ptなど)をタンパク質結晶内に導入する方法で位相を決め、最終的にタンパク質構造のモデルを構築します。タンパク質の質の良い単結晶が十分量確保できるかどうかがその成否を左右します。生体に含まれている量が少なく、ごく微量しか分離できなかったタンパク質でも、微生物などに組み換えタンパク質を生産させて十分な量を得ることができるようになり、非常に多くのデータが蓄積してきました。なお、図14-1の画面の[X-ray Resolution]で分解能を指定して目的タンパク質のX線結晶解析データを検索することもできます。分解能はÅ(オングストローム)で表示されます。

 

 

核磁気共鳴(NMR)による構造決定

核磁気共鳴(NMR)は水溶液中のタンパク質の構造を推定するため、結晶化できないタンパク質の解析に有効です。また、タンパク質の動的な構造の解析、フレキシブルで不規則な構造の解析も可能です。しかし、超高磁場磁石(プロトンの共鳴周波数で800 Hz)でも分子量が3万程度までのタンパク質しか解析できませんでしたが、さらに大きなタンパク質が扱えるようになってきています。この方法は強い磁場に置かれた水素原子(プロトン、1H)の核スピンの共鳴を観察する方法です。化学シフト、スピン結合、核オーバーハウザー効果などを測定する方法が開発され、立体構造の解析に用いられます。アミノ酸が60個程度までのタンパク質では二次元DQFCOSY, TOCSY, NOESYの3種のスペクトルを測定し、より大きいタンパク質では15Nと13Cとで二重に標識して異種多次元NMR法で測定して主鎖の帰属が行えます。

 

 

ラクトフェリンの抗体結合部位の構造比較

第3章で作成したウシラクトフェリンCローブに対するモノクローナル抗体の反応性を調べると、興味ある結果が得られました。第10章で決定した抗体結合部位の配列が、ヒトラクトフェリンにも存在しています。しかし、ELISA法やドットブロット法による検定では、ウシラクトフェリンCローブに対するモノクローナル抗体に対する反応性は認められませんでした。そこでポリペプチド主鎖の折りたたみ構造をウシとヒトのラクトフェリンについて比較したところ、図14-2に示したようにその重なりの度合いが非常に高いことが分かりました。これはモノクローナル抗体との反応が主鎖ではなく側鎖との相互作用であること、またそれらの配向が微妙に異なっていることを示唆していると考えられました。あるいはここで示した抗体結合部位とは離れたペプチド鎖の影響を受けている可能性もあります。そこでラクトフェリンを変性させてからELISAプレートに吸着させ、抗ウシラクトフェリンCローブモノクローナル抗体、次いでペルオキシダーゼ標識抗体で反応させたところ、ヒトラクトフェリンにもはっきりとした反応が認められました。抗体結合部位近傍の主鎖、側鎖の状態を分子モデルで詳細に調べたところ、未変性のヒトラクトフェリンでは667Gln, 670Ala, 671Gly, 675Leuが抗体との結合を妨げているものと結論されました2)。なお、図14-3に示したものは、図14-2で示したペプチド部分を含むドメインの主鎖の構造モデルです。


図14-3. ProteinAdviser(富士通九州システムエンジニアリング)によって示した、ウシとヒトラクトフェリンの抗体結合部位のポリペプチド主鎖の重なり具合2)。アミノ酸配列AGWNIPMLIはウシラクトフェリンでは465-474、ヒトラクトフェリンでは468-477に存在。

図14-4.ウシラクトフェリンのCローブのドメインの一つ(464-498)は、抗Cローブモノクローナル抗体との反応部位を含んでいます2)。このドメインはα5(463-479)とα6(482-486)の二つのヘリックス、βg(488-492)の一本のβストランドを含んでいます。(ProteinAdviserで表示)

補足

a)RCSB PDB(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Base)のURLアドレスや分子モデル表示のためのフリーウエアの所在は付録のウエッブサイト一覧を参照して下さい。

b) タンパク質・ペプチドを主とする生体高分子の立体構造に関するデータベースは上記RCSB PDBの他にも複数あり、それらデータベースを統合的に保守・公開するためwwPDB (World Wide Protein Data Bank) が2003年に結成されています。さらに、立体構造データの形式について2014年より新しいフォーマット(PDBV/mmCIF)に変更されるとアナウンスされています。

c)ほとんどのソフトウエアは日本語で表示されたフォルダ、ディレクトリ、ファイルは認識しないので、特にデータを格納するフォルダーの階層や名称には注意してください。

d) X線結晶解析データから分子モデルを表示させた場合、単量体タンパク質のはずなのに2分子がセットになって表示される場合があります。そのような時はpdbファイルをテキストファイルとして開いて座標データを表示させて、繰り返し部分を削除することで対応できます。

e) 図14-2で用いたVMDとCMol(iPad使用)についての簡単な操作法を 日本ラクトフェリン学会ニュースレター外部リンク No.7とNo.11に掲載してあります。なお、「どの分子モデル表示ソフトを使ったらよいか」は使用目的によりますが、求める機能に関する操作の容易さ、たとえば各種操作がメニュー形式で容易にできるソフトか、あるいはコマンド操作で細かな指定を行うソフトかなどは選択する際の判断基準の一つになります。さらに表示の種類の多さや見た目の美しさ、様々に加工して表示した分子モデルを保存する画像のファイル形式が、使っているパソコンやソフトウエアで利用できる形式かどうかも、結果を利用する際に重要となります。

f) 1オングストローム (en: angstrom, Å) は 0.1ナノメートル (nm)。

g) 空間充填モデルは球 (ball)モデルあるいはCPKモデルといわれます。

h) NMR測定に用いるため、同位体 15N, 13C でタンパク質を標識するには、標識アミノ酸を取込んだタンパク質を調製します。そのために組換え体も利用されます。

i) NMRでの化学シフトとは、異なる環境にある核の共鳴周波数に差が生じることです。スピン結合とは核スピン間の相互作用として観察され、相関分光法(COSY)、DQF-COSY(二量子フィルターによる相関分光法)、TOCSY(全相関分光法)などの方法で測定します。核オーバーハウザー効果(NOE)はスピン間の相互作用で生じる現象で、NOESY (NOE Spectroscopy)で観測します。

参考図書

1) Moore,S.A., et al., J. Mol. Biol., 274, 222-236 (1997)
2) Nam,M.-S., et al., Food Agr. Immunol., 14, 141-148 (2002)

「新生化学実験講座1タンパク質-III 高次構造」日本生化学会編、東京化学同人、67-90 (X線), 91-150, 151-190 (NMR)(1990)
「タンパク実験プロトコル2.構造解析編」189-220、秀潤社(1997)(RasMol操作法)
「基礎生化学実験法・第3巻タンパク質 I 検出・構造解析法」日本生化学会編、東京化学同人(2001)
「シリーズ・あなたにも役立つバイオインフォマティクス」蛋白質・核酸・酵素46巻13号(10月号、立体構造の入手)2003-2008 (2001)
15号(12月号、立体構造の類似性)2198-2204
47巻2号(2月号、アミノ酸配列から立体構造を予測する)181-186
「タンパク質と核酸の分離精製(基礎と実験)」(化学と生物実験ライン48)寺田弘編、307-321, 廣川書店(2001)(立体構造予測)

問題

問1.PDBにアクセスしてウシラクトフェリンのX線結晶解析データをダウンロードし、そのヘッダー部分と座標データの一部をプリントして示し、それらがどのような意味を持っているかを説明して下さい。

問2.RCSB PDBからダウンロードしたウシラクトフェリンあるいはヒトラクトフェリンの立体構造を、RasMolなどの分子モデル表示用のフリーウエアを用いて表示し、以下の一連の操作を行って下さい。

2-1. ラクトフェリンの立体構造をリボンまたはcartoonモデルで表示して下さい。図14-2を参照してバックグランドの色調を白に設定し、鉄イオンは識別し易いようにspacefill(空間充填)モデルで表示し、かつ色調をタンパク質とは変えて下さい。

2-2. ラクトフェリシン部分あるいはこれまでに述べた抗原決定基の部分を識別できるように色分けして表示して下さい。完成したモデルを文章やスライドに貼り付けることの出来る形に保存し、プリントしてみて下さい。

2-3. ラクトフェリンのNローブとCローブを識別できるように表示して下さい。

2-4. ラクトフェリン分子に結合している2個の鉄イオン間の距離を求めてください。

2-5. ラクトフェリン分子のおおよそのサイズを求めてください。

問3. ラクトフェリンの一部であるラクトフェリシンの高次構造のデータを検索し、立体構造を表示してください。ラクトフェリン分子の一部となっている場合と、遊離の状態とで立体構造は同じですか。あるいは異なりますか。異なるとすればどのような違いがありますか。

提供:北海道大学名誉教授 島崎 敬一

(2014年7月 改訂)

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