タンパク質調節に不可欠な翻訳後修飾 CYTOSKELETON NEWS 2015年8月号

細胞は、恒常性を維持するために、細胞内および細胞外環境の変化に対応する必要があります。変化の中には、細胞損傷や細胞死につながる有害な影響を避けるために、迅速に起こるものがあります。タンパク質の翻訳後修飾（PTM）は細胞の方略のひとつであり、多くのタンパク質の特性（酵素活性、タンパク質相互作用、細胞内局在など）に影響を与えることにより、細胞が様々な変化に迅速に対応することができます。質量分析（MS）の発達により、大規模なPTMの同定が可能になりました。今日では、小さな化学的修飾（例： リン酸化やアセチル化）から、完全なタンパク質の付加（例： ユビキチン化やSUMO化）に至るまで、200を超えるPTMが知られています^1,2。最も広く研究されているPTMは、プロテインキナーゼがセリン、スレオニン、チロシン残基にリン酸基を付加するリン酸化です。リン酸化されたタンパク質は、多様かつ重要な細胞プロセスにおいて、きわめて重大な役割を果たしていると考えられます。ヒストンタンパク質のアセチル化は、約50年前に発見され³、クロマチン構造の調節に関与することが知られてきました⁴。プロテオミクス研究により、約 2,000 タンパク質に渡って、5,000 のアセチル化部位が同定されました^5,6。アセチル化タンパク質の大部分は、細胞質、ミトコンドリア、細胞膜に局在することから、シグナル伝達、細胞骨格のダイナミクス、膜の安定性などの多様な細胞プロセスに関与していると考えられます^5,6。リジン残基は、アセチル化に加えて、ユビキチン化やSUMO化によって修飾されることが報告されており、ユビキチン化はプロテアソーム経路を介したタンパク質分解において重要な役割を果たし⁷、SUMO化は細胞周期、アポトーシス、DNA修復、シグナル伝達経路などの細胞プロセスの調節において重要です⁸。

図1 過酸化水素・過バナジン酸ナトリウムで処理／未処理の NIH3T3 細胞のライセートを、ホスホチロシン抗体（品番： APY03）-ビーズとインキュベートし、チロシンリン酸化タンパク質を濃縮した。 PTMtrue™ 抗体を用いてウェスタンブロット解析し、濃縮されたチロシンリン酸化タンパク質（pY）から、複数の翻訳後修飾を受けたタンパク質（1B-1D）を検出した。

PTMのクロストーク

PTMのクロストークは、最近、プロテオミクス研究領域で注目されています。二つの別の研究グループが、バイオインフォマティクスとタンパク質配列のデータベース解析により、異なる種類のPTMが近接して（約アミノ酸15残基離れて）位置する「ホットスポット」を同定しました^9,10。これらの「ホットスポット」は、クロストークする場合があることが報告されています^1,2。濃縮方法や質量分析（MS）技術の発達により、複数の研究グループが、細胞環境における包括的なPTMのプロテオーム解析を行っており^11-13、タンパク質分解¹¹ および SUMO化が調節するタンパク質リン酸化（例： カゼインキナーゼ II）において、リン酸化とユビキチン化とがクロストークすることが示されました¹²。PTMのクロストークには、ネガティブとポジティブが存在します。ポジティブなクロストークでは、最初のPTMが次のPTMの追加／除去のシグナルとして作用するか、次の修飾を行う結合タンパク質の認識シグナルとして作用します（例： リン酸化に依存したSUMO化）¹⁴。ネガティブなクロストークでは、タンパク質中の１つの残基の修飾のために直接的に競争するか^15,16、次のPTMの認識部位をマスクことで間接的に作用します^15,16。また、１つのタンパク質が複数の修飾を受けることを示す多くの例があります¹。このようなPTMの作用が組み合わさることによって、真核生物におけるプロテオーム研究の幅が広がり、また、タンパク質の機能、局在、他の分子との相互作用などを微調整するメカニズムとなり得ます。

Cytoskeleton社では、目的のタンパク質のPTMの研究に使用できる、PTMtrue™ 抗体をご提供しております。最近では、抗ホスホチロシン（pY）抗体（品番： APY03） および 抗 SUMO-2/3 抗体（品番： ASM24）とプロテインGビーズを架橋した、PTM 濃縮ビーズを開発しました。図1および図2は、Cytoskeleton社の PTM 濃縮ビーズを使用して、複数のPTMを受けたタンパク質を検出した結果を示しています。チロシンリン酸化タンパク質を濃縮するために、過酸化水素・過バナジン酸ナトリウムで処理／未処理の NIH3T3 細胞のライセートを、ホスホチロシン抗体（品番： APY03）-ビーズとインキュベートしました。SUMO-2/3 標的タンパク質の濃縮は、ヒートショック処理／未処理の HeLa 細胞ライセートを PTM 濃縮ビーズとインキュベートすることで行いました。濃縮したタンパク質をビーズから溶出し、SDS-PAGE ゲル上で分解しました。その後、タンパク質を PVDF 膜に転写し、PTMtrue™ 抗体［抗pY（品番： APY03）、抗SUMO-2/3（品番： ASM23）、抗ユビキチン（品番： AUB01）、抗アセチルリジン（品番： AAC01）］を用いて、濃縮プール中の特定のPTMを受けたタンパク質を検出しました。図1Aおよび図2Aに示すように、２種類の濃縮ビーズはどちらも、PTMを受けた標的タンパク質に対して、優れたプルダウン能力を示します。また、PTMtrue™ 抗体を用いて、pY および SUMO-2/3 濃縮プールから、複数のPTMを受けたタンパク質を検出することも可能です（図1B-D; 2B-D）。

図2 ヒートショック（43℃）処理／未処理の HeLa ライセートを PTM 濃縮ビーズ（品番： ASM24-BEADS）とインキュベートし、SUMO-2/3 標的タンパク質を濃縮した。PTMtrue™ 抗体を用いたウェスタンブロット解析により、SUMO-2/3 濃縮プールから、複数のPTMを受けたタンパク質（2B-2D）を検出した。

まとめ

PTMのクロストークの研究には、２つの障害が存在します。１つは、PTMは多くの場合、準化学量論的な（モル比で少ない）レベルで存在するため、非常に特異的な方法で濃縮する必要があることです。もう１つは、プロテオミクス研究には、一般的に、インタクトなタンパク質の代わりにトリプシンで消化されたペプチドが用いられるため、多くの場合、１つのタンパク質アイソフォーム上に存在する複数の修飾の関連性が断たれてしまうからです。Cytoskeleton社では、内在性レベルのPTMタンパク質を検出し濃縮する、非常に特異的な PTM 抗体をご提供しております。

■ CYTOSKELETON NEWS バックナンバー

• 2020年10月号　紡錘体 - 可視化に向けた新規ツール
• 2020年8月号　細胞膜染色用蛍光プローブ
• 2020年4月号　生細胞におけるF-アクチンプローブ
• 2020年3月号　コロナウイルスと細胞骨格
• 2020年2月号　タウ（Tau）の将来性をMapping
• 2020年1月号　Rho GTPaseによる細胞遊走制御

• 2019年12月号　表現型プロファイリング：アクチンに焦点を当てたがん治療
• 2019年11月号　チューブリンの過剰グルタミル化、ミトコンドリア、神経変性
• 2019年9月号　細胞運動性を制御するために相互作用する膜張力とアクチン細胞骨格
• 2019年8月号　Rac1B、がん、およびRac1
• 2019年7月号　Rhoファミリー GTPases、神経可塑性、およびうつ状態
• 2019年6月号　アクチンメチオニン酸化： 動的制御の次の段階
• 2019年5月号　ミクログリアと神経変性疾患
• 2019年2月号　生細胞画像化に対するCNS疾患や障害

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