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G-LISAを用いた心臓研究: 糖尿病性心筋症におけるRho経路に関する研究 CYTOSKELETON NEWS 2012年3月号

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CYTOSKELTON NEWS 2012年3月号 G-LISAを用いた心臓研究: 糖尿病性心筋症におけるRho経路に関する研究

G-LISAを用いた心臓研究: 糖尿病性心筋症におけるRho経路に関する研究

Rho/ROCK経路は心血管疾患における心性高血圧の調整に関与しているとされています1。主な効果はアクトミオシンの細胞骨格の張力を調製することにあります2,3,4,5。RhoAの活性化が誘導されることで様々種類の細胞においてアクチン構造の再構成が引き起こされることは十分に立証されています。心組織において、一連の再構成により細胞膜におけるリポプロテインリパーゼ(LPL)の局在の増加が起こり6,7、その結果糖質酸化に代わって脂質代謝(カイロミクロンや超低比重リポタンパクの分解)への依存が高まります8。同様の生理現象が2型糖尿病の高血糖状態においても引き起こされ、糖尿病における細胞の低代謝状態を悪化させます7,8。Rhoタンパクの活性化は細胞骨格の細胞での移動に対する細胞外シグナルの経路の中心となっており、したがってLPLの再局在はRhoタンパクの活性化に依存しています6。LPLの細胞膜への移動を引き起こす経路はアディポネクチン受容体-Rho-ROCK経路とAMPK-p38-MK経路の2種類があると考えられています(Figure 1)。LPL歳局在の生理学的に正常な原因はAMP活性化タンパク質キナーゼ(AMPK)によって検出される低エネルギー状態に対する反応です。このキナーゼはp38 MAPKをリン酸化し、リン酸化されたp38 MAPKは核に移行し、MAPK活性化タンパク質キナーゼ2 (MK2)の翻訳を亢進します。MK2はHSP25リン酸化し、HSP25はアクチン単量体からはずされ、結合のための遊離アクチンの大きなプールを作り出します8。この一連の反応に合わせて、血流中のアディポネクチンがその細胞外受容体に結合しRho/ROCK経路を活性化します。その結果、細胞膜に向かう適切な場所でF-アクチン線維の形成が引き起こされます6

 

Figure 1. LPL再局在を制御するシグナル伝達経路

LPL再局在を制御するシグナル伝達経路

アディポネクチンといった細胞外因子や低エネルギー状態といった細胞内の合図によりAMPKPho/ROCKを介した経路が誘導され、LPLがゴルジ体から細胞膜に輸送され、細胞骨格の骨組みが形成されます。 

 

CYTOSKELTON社が提供するG-LISAフォーマットは心臓研究において利用可能な少量の心筋細胞や大動脈組織を用いたRhoタンパク活性の測定を可能にしています。このフォーマットには以下のような利点があります4,6,9。1)従来のウェスタンブロット法による解析10に比べ精度が向上します(CV=13%)、2)迅速なプロセッシング、3)少量サンプル(10-50mgタンパク)での解析が可能、4)経 済的である。これらの利点により研究者の方々がこれまでの方法では測定できなかった幅2mm、長さ8mm程度のマウス大動脈といったより小さな組織を用いてRhoタンパクの活性を測定することが可能となります4,6,9
加えて、ある環境下でGTP-Rhoシグナルを検出限界以下まで下げてしまうリン酸化酵素が高い濃度で混入するために、大動脈ホモジネートを用いたRhoAに関する研究は難しいとされてきました。したがって、大動脈ホモジネートにはGTP-Rhoシグナルが測定に十分な時間安定化するためにリン酸化酵素阻害剤を加える必要がありました。阻害剤には人工基質の混合物や、セリン/スレオニンリン酸化酵素の阻害剤が使用されます。

CYTOSKELTON社では阻害剤として50mM NaF、20mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM ミクロシスチン、1mM オルトバナジウム酸を推奨しています。これらの阻害剤を使用しない場合、研究者の方々の中には類似した低い(低下した)GTP-Rhoシグナルを検出することがあります。

最終的には、Rhoタンパク特異的阻害剤および活性剤は神経再生を示すBioaxone社のBA-210(Cethrin®)といった医薬品を使用する傾向にあります。
CYTOSKELTON社ではRho経路研究のための細胞透過性の高いRho阻害剤(Cat. #CT04)と活性剤(Cat. #CN03)を提供しています。

参考文献

1. Hong Z and Yong-Jun L. 2010. RhoA/Rho kinase: a novel therapeutic target in diabetic complications. Chinese Mediacal Journal. 123: 2461-2466.

2. Hirata et al., 1992. Involvement of Rho p21 in the GTP-enhanced calcium ion sensitivity of smooth muscle contraction. J. Biol. Chem., 267, p.8719-8722.

3. Gong et al., 1995. Arachidonic acid and diacylglycerol release associated with inhibition of myosin light chain dephosphorylation... . J. Physiol., 486, p. 113-122.

4. Matsumoto et al., 2010. Enhancement of mesenteric artery contraction to 5-HT depends on Rho kinase and Src kinase pathways in the ob/ob mouse model of type 2 diabetes. Br J Pharmacol., 160(5): 1092–1104.

5. Yang et al., 2012. Mechanism of fibrotic cardiomyopathy in mice expressing truncated Rho-associated coiled-coil protein kinase 1. FASEB J. Jan 25th e-pub ahead of print.

6. Ganguly et al., 2011. Adiponectin increases LPL activity via RhoA/ROCK-mediated actin remodeling in adult rat cardiomyocytes. Endocrinology, 152, p.247-254.

7. Punlinilkunnil and Rodrigues, 2006. Cardiac lipoprotein lipase: Metabolic basis for diabetic heart disease. Cardiovasc. Res., 69, p.329-340.

8. Kim et al., 2007. Acute diabetes moderates trafficking of cardiac lipoprotein lipase through p38 mitogen-activated protein kinase-dependent actin cytoskeleton organization. Diabetes, 57, p.64-76.

9. Seok et al., 2008. Isoflavone Attenuates Vascular Contraction through Inhibition of the RhoA/Rho-Kinase Signaling Pathway. J. Pharmacol. Exp. Ther., 326, p.991–998.

10. Benard and Bokoch, 2002. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol., 345, p.349-359.

RhoA G-LISA® & ELISAキット

CN01とLPAによるSwiss 3T3細胞Rhoタンパク活性の時間経過による推移

CN01とLPAによるSwiss 3T3細胞Rhoタンパク活性の時間経過による推移
血清不足状態のSwiss 3T3細胞をRho活性剤(Cat. #CN01:青)およびLPA(赤)で処理した。RhoA活性は490nmにおける吸光度により測定した。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RhoA G-LISA(R) Activation Assay (luminescence)詳細データ CYT BK121 96 ASSAY
¥264,000
RhoA G-LISA(R) Activation Assay (absorbance)詳細データ CYT BK124 96 ASSAY
¥264,000
RhoA ELISA Kit詳細データ CYT BK150 1 KIT
[96 assays]
¥145,000

GEF&GAPアッセイ

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RhoGEF Exchange Assay詳細データ CYT BK100 1 KIT
[60-300 assays]
¥197,000
Rho GAP Assay Kit (non-radioactive)詳細データ CYT BK105 1 KIT
[80-160 assays]
¥196,000

Rhotekin-RBDビーズ

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Rhotekin-RBD, Human詳細データ CYT RT01-A 1*500 UG
¥134,000
Rhotekin-RBD on agarose beads詳細データ CYT RT02-A 2*2 MG
¥176,000
Rhotekin-RBD on agarose beads詳細データ CYT RT02-B 6*2 MG
お問い合わせ

RhoA抗体

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti RhoA w/positive control, Human (Mouse) 詳細データ CYT ARH03-A 2*50 UG
販売終了
Anti RhoA w/positive control, Human (Mouse) 詳細データ CYT ARH03-B 6*50 UG
販売終了

Rhoアクチベーター&インヒビター

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Rho Activator詳細データ CYT CN01-A 5*10 UNIT
¥61,000
Rho Activator詳細データ CYT CN01-B 20*10 UNIT
¥220,000
Rho Activator II詳細データ CYT CN03-A 3*20 UG
¥61,000
Rho Activator II詳細データ CYT CN03-B 9*20 UG
¥170,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I詳細データ CYT CN04-A 3*20 UG
¥61,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I詳細データ CYT CN04-B 9*20 UG
¥170,000
Rho Pathway Inhibitor I (Rho Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632)詳細データ CYT CN06-A 5*10 UNIT
販売終了
Rho Pathway Inhibitor I (Rho Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632)詳細データ CYT CN06-B 20*10 UNIT
販売終了
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-A 1*20 UG
¥61,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-B 5*20 UG
¥182,000

Rhoモジュレーター&エフェクタータンパク質

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
C3 Transferase Exoenzyme Protein Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT03-A 1*25 UG
¥61,000
C3 Transferase Exoenzyme Protein Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT03-C 4*25 UG
¥211,000
Rho GAP Protein詳細データ CYT GAP01-A 1*50 UG
¥84,000
Rho GAP Protein詳細データ CYT GAP01-B 4*50 UG
¥205,000
Rho GAP Protein: catalytic domain GST詳細データ CYT GAS01-A 1*50 UG
¥84,000
Rho GAP Protein: catalytic domain GST詳細データ CYT GAS01-B 4*50 UG
¥205,000
GDP dissociation inhibitor protein詳細データ CYT GDI01-A 1*25 UG
¥84,000
Dbs protein GEF domain - His tagged詳細データ CYT GE01-A 2*50 UG
¥85,000

Rhoタンパク質

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RhoA Protein: constitutively active, Human詳細データ CYT R6301-A 1*10 UG
¥120,000
Rho A His Protein: wild type, Human詳細データ CYT RH01-A 1*100 UG
¥120,000
RhoA His Protein: wild type, Human詳細データ CYT RH01-C 3*100 UG
¥211,000
Rho A His Protein: wild type, Human詳細データ CYT RH01-XL 1*1 MG
お問い合わせ
RhoC His Protein: Wild type詳細データ CYT RH03-A 1*100 UG
¥120,000
RhoA GST Protein: wild type, Human詳細データ CYT RHG01-C 8*25 UG
¥176,000

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