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チロシンリン酸化は Rhoファミリー GTPase 活性を調節する CYTOSKELETON NEWS 2016年5月号

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CYTOSKELETON NEWS 2016年5月号 チロシンリン酸化は Rhoファミリー GTPase 活性を調節する

チロシンリン酸化は Rhoファミリー GTPase 活性を調節する

低分子量Gタンパク質の Ras スーパーファミリーには、Ras、Rho、Rab、Arf、Ran などのサブファミリーが含まれ、 幅広く細胞機能を調節することが示されています。GTPase には、不活性型のGDP結合型と、活性型のGTP結合型が存在し、両者の転換により、細胞内のシグナル伝達の分子スイッチとして機能します。Rho サブファミリーには、Rho、Rac、CDC42 が含まれ、主に細胞外増殖因子に応答した細胞骨格の調節に関与すると考えられています。近年の研究では、膜輸送、転写制御、細胞増殖制御、発生などの様々な細胞イベントにおいても、重要な役割を果たしていることが示されています1。GTPase を介したシグナル伝達の効率は、活性型/非活性型 GTPase の比率に依存します。活性型 GTPase の量は、様々な経路で変化します。(1)グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)によりGDPの解離が促進され、GTPが結合することで活性化が促進される、(2)グアニンヌクレオチド解離阻害因子(GDI)によりGDPの解離が阻害される、(3)GTPase 活性化タンパク質(GAP)によりGTPからGDPへの加水分解が促進され、活性型 GTPase の量が減少する1(図1)。さらに、Rho GTPase シグナル伝達経路の上流および下流において、チロシンリン酸化などの修飾は重要です。本稿では、Rho サブファミリー GTPase 活性の調節において、チロシンリン酸化の果たす役割について考察します。

Rho GTPase 活性は、Rho GEF により厳密に調節されます。チロシンリン酸化により、RhoGEF (Vav および Dbl)は直接活性化されます。GEFとして知られている Vav、Dbl ファミリーは、両者とも Dbl ホモロジー領域(DH)と Pleckstrin ホモロジー領域(PH)からなる Rho GTPase 結合部位を持っています。不活性状態では閉じた構造をとり、Rho GTPase は DH-PH 結合ドメインに接近することができません。刺激(例:上皮成長因子[EGF])を受けると、複数のチロシン残基(あるいはセリン/スレオニン残基)が連続的にリン酸化され、自己抑制状態が構造的に緩和されます。その結果、Rho GTPases がこの触媒部位へ結合することが可能になり、基質の GDP から GTP へのヌクレオチド交換が刺激されます2-4

Rho GTPase の細胞膜への局在化には、細胞膜に結合したGEFによる活性化と、エフェクタータンパク質の結合が必要です。RhoGDI は、Rho GTPase の細胞質と細胞膜の間の循環に、重要な役割を果たしています。RhoGDI は、細胞質基質の Rho GTPase と複合体を形成し、Rho GTPase が活性化される細胞膜への局在化を妨げます(図1)。恒常的活性化型 Src 非受容体型チロシンキナーゼを発現する細胞では、RhoGDI の Tyr-156 がリン酸化されることで、Rho GTPase との複合体形成能が著しく減少し、その結果として Rho GTPase が細胞膜に局在化し、活性化されて機能します。GTPの加水分解により Rho GTPase が不活性化された後、RhoGDI が非活性化型 Rho GTPase と再結合し、Rho GTPase の細胞質基質へのリサイクルを仲介している可能性があります5

GTPase を介したシグナル伝達の恒常性を維持するために、Rho GAP は、GTPの加水分解を促進することで、活性型 Rho GTPase を不活性型のGDP結合型に変換します。チロシンリン酸化は、Rho GAP 活性に正と負の両方の作用を示します。Sordella らによる研究から6、マウス胚線維芽細胞(MEF)での、インスリン様成長因子1(IGF-1)による p190-B RhoGAP の Tyr-306 のリン酸化は、GAP活性に直接影響を与えないことが示されています。その代わりに、p190-B RhoGAP の細胞膜(脂質ラフト)への急速な再分布を引き起こし、細胞膜に局在する活性型 Rho に作用します6。Kai らによる別の研究で7、EGF刺激による、b2-キメリン(Rac 特異的 GAP) Tyr-21 の Src ファミリーキナーゼを介したリン酸化により、GAP活性が負に調節されることが示されています。そのメカニズムとして、調節タンパク質との結合が促進されるか、Rac GAP の Rac 結合ドメインと活性型 Rac(Pro-23 および Pro-24)との間に立体的な阻害が誘導されることにより、GTPの加水分解を介して Rac を不活性化する能力が低下する可能性が考えられます7

チロシンリン酸化は、Rho ファミリー GTPase の活性化や結合パートナーの調節に重要な役割を果たす。

図1 チロシンリン酸化は、Rho ファミリー GTPase の活性化や結合パートナーの調節に重要な役割を果たす。

また、複数の研究で、Rho GTPase が直接チロシンリン酸化されると、本来の局在、活性、結合パートナーが調節されることが示されています。EGFは、Cdc42 のリン酸化と、Vav2 を介した活性化を刺激します。EGFを介した Cdc42 の Tyr-64 のリン酸化は、Src チロシンキナーゼにより仲介され、活性型 Cdc42 と RhoGDI との結合を亢進させます。興味深いことに、Cdc42 のリン酸化は、Cdc42 の活性化や、エフェクターとの相互作用には必要ありません。活性型 Cdc42 は、RhoGDI と結合すると細胞膜から放出され、細胞内の別の場所への移動が促進されます。その場所で、異なるターゲット/エフェクターと結合し、重要な細胞の形質転換イベントを制御している可能性があります8。また、Rac1 も、in vitro において、Src および FAK により Tyr-64 がリン酸化されます。Rac1-Y64D(リン酸化を模倣したコンストラクト)を過剰発現させた結果から、Rac1 の Tyr-64 のリン酸化は、細胞の伸展、接着班への局在、GTP・RhoGDI・GEF・エフェクタータンパク質 PAK との結合を負に制御することが示唆されます9。非定型 Rho ファミリー GTPase である Wrch-1/RhoU についての研究では、C末端の membrane targeting domain の Tyr-254 が Src を介してリン酸化されると、Wrch-1 が GTP/GDP 結合の変化を介して細胞膜から細胞内膜へ再局在化し、エフェクタータンパク質であるPAKをリクルートして活性化する能力が低下することが示されています10

Rho GTPase は、Rho GEF、Rho GAP、RhoGDI によって厳密に調節されており、多くの重要な細胞イベントの分子スイッチとして機能します。さらに、Rho GTPase シグナル伝達カスケードでは、タンパク質のユビキチン化・SUMO化・リン酸化・アセチル化などの翻訳後修飾により、Rho GTPase の機能や局在が効果的に微調整されています。Cytoskeleton社では、目的のタンパク質が様々な修飾によりどのように調節されているかを研究するためにご使用いただける、Signal Seeker™ パスウェイツールキットシリーズを開発しました。独自の溶解バッファーにより、同じライセートサンプルから、異なる翻訳後修飾を受けたタンパク質を濃縮することができ、ターゲットタンパク質の様々な修飾による相互作用の研究を簡単に行うことが可能になりました。

参考文献
  1. Jaffe A.B. and Hall A. 2005. Rho GTPases: biochemistry and biology. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269.
  2. Gupta M. et al. 2014. Tyrosine phosphorylation of Dbl regulates GTPase signaling. J. Biol. Chem. 289, 17195-17202.
  3. Patel M. et al. 2014. Phosphorylation-mediated regulation of GEFs for RhoA. Cell Adh. Migr. 8, 11-18.
  4. Bi F. et al. 2001. Autoinhibition mechanism of proto-Dbl. Mol. Cell. Biol. 21, 1463-1474.
  5. DerMardirossian C. et al. 2006. Phosphorylation of RhoGDI by Src regulates Rho GTPase binding and cytosol-membrane cycling. Mol. Biol. Cell. 17, 4760-4768.
  6. Sordella R. et al. 2003. Modulation of Rho GTPase signaling regulates a switch between adipogenesis and myogenesis. Cell. 113, 147-158.
  7. Kai M. et al. 2007. Tyrosine phosphorylation of beta2-chmaerin by Src-family kinase negatively regulates its Rac-specific GAP activity. Biochim. Biophys. Acta. 1773, 1407-1415.
  8. Tu S. et al. 2003. Epidermal growth factor-dependent regulation of Cdc42 is mediated by Src tyrosine kinase. J. Biol. Chem. 278, 49293-49300.
  9. Chang F. et al. 2011. Tyrosine phosphorylation of Rac1: A role in regulation of cell spreading. PLoS ONE. 6, e28587.
  10. Alan J. et al. 2010. Regulation of Rho family small GTPase Wrch-1/RhoU by C-terminal tyrosine phosphorylation requires Src. Mol. Cell. Biol. 30, 4324-4338.

抗体

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti Rac1 specific (Mouse) 詳細データ CYT ARC03 2*100 UL
¥105,000
Anti Rac1 specific, sample size (Mouse) 詳細データ CYT ARC03-S 1*25 UL
¥30,000
Anti Cdc42, Human (Mouse) , 4B3詳細データ CYT ACD03 2*200 UL
¥105,000
Anti Cdc42,  (Mouse) , 4B3詳細データ CYT ACD03-S 1*50 UL
販売終了
Anti RhoA w/positive control (Mouse) 詳細データ CYT ARH04 2*200 UL
販売終了
Anti RhoA w/positive control (Trial size) (Mouse) 詳細データ CYT ARH04-S 1*50 UL
販売終了

G-Switch 活性化剤&阻害剤

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Rho Activator詳細データ CYT CN01-A 5*10 UNIT
¥61,000
Rho Activator詳細データ CYT CN01-B 20*10 UNIT
¥220,000
Rac and Cdc42 Activator詳細データ CYT CN02-A 5*10 UNIT
¥61,000
Rac and Cdc42 Activator詳細データ CYT CN02-B 20*10 UNIT
¥220,000
Rho Activator II詳細データ CYT CN03-A 3*20 UG
¥61,000
Rho Activator II詳細データ CYT CN03-B 9*20 UG
¥170,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I詳細データ CYT CN04-A 3*20 UG
¥61,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I詳細データ CYT CN04-B 9*20 UG
¥170,000
C3 Transferase Exoenzyme Protein Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT03-A 1*25 UG
¥61,000
C3 Transferase Exoenzyme Protein Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT03-C 4*25 UG
¥211,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-A 1*20 UG
¥61,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-B 5*20 UG
¥182,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-C 20*20 UG
お問い合わせ

Gタンパク質 エフェクタータンパク質&キット

[商品詳細]

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RhoGEF Exchange Assay詳細データ CYT BK100 1 KIT
[60-300 assays]
¥197,000
Rho GAP Assay Kit (non-radioactive)詳細データ CYT BK105 1 KIT
[80-160 assays]
¥196,000
Rho GAP Protein詳細データ CYT GAP01-A 1*50 UG
¥84,000
Rho GAP Protein詳細データ CYT GAP01-B 4*50 UG
¥205,000
Rho GAP Protein: catalytic domain GST詳細データ CYT GAS01-A 1*50 UG
¥84,000
Rho GAP Protein: catalytic domain GST詳細データ CYT GAS01-B 4*50 UG
¥205,000
GDP dissociation inhibitor protein詳細データ CYT GDI01-A 1*25 UG
¥84,000
SOS1 Ras GEF protein, Human詳細データ CYT CS-GE02 100 UG
[1 x 100 μg]
販売終了
SOS1 Ras GEF protein, Human詳細データ CYT CS-SOS1-B 1 MG
[1 x 1 mg]
販売終了

G-LISA® 活性型低分子量Gタンパク質アッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Rac1 G-LISA(R) Activation Assay Kit詳細データ CYT BK126 1 KIT
[96 assays]
¥264,000
Rac1 G-LISA(R) Activation Assay Kit詳細データ CYT BK128 1 KIT
[96 assays]
¥264,000
Rac1 G-LISA(R) Activation Assay Kit, Trial Size詳細データ CYT BK128-S 24 ASSAY
¥160,000
Cdc42 G-LISA(R) Activation Assay Kit詳細データ CYT BK127 96 ASSAY
¥264,000
Cdc42 G-LISA(R) Activation Assay Kit, Trial Size詳細データ CYT BK127-S 24 ASSAY
¥160,000
RhoA G-LISA(R) Activation Assay (absorbance)詳細データ CYT BK124 96 ASSAY
¥264,000
RhoA G-LISA(R) Activation Assay (absorbance), Trial Size詳細データ CYT BK124-S 24 ASSAY
¥160,000
RhoA G-LISA(R) Activation Assay (luminescence)詳細データ CYT BK121 96 ASSAY
¥264,000

Signal Seeker™ キット

PTM抗体

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti Acetyl Lysine,  (Mouse) , 3C6.08.20詳細データ CYT AAC01 200 UL
[2 x 100 μl]
¥105,000
Anti Acetyl Lysine (Trial size),  (Mouse) , 3C6.08.20詳細データ CYT AAC01-S 25 UL
[1 x 25 μl]
¥30,000
Anti Acetyl Lysine詳細データ CYT AAC01-BEADS 2*200 UL
販売終了
Anti Phosphotyrosine,  (Mouse) , 27B10.4詳細データ CYT APY03 2*100 UL
¥105,000
Anti Phosphotyrosine (Trial Size),  (Mouse) , 27B10.4詳細データ CYT APY03-S 1*25 UL
¥30,000
Anti Phosphotyrosine Affinity Beads,  (Mouse) , 27B10.4詳細データ CYT APY03-BEADS 4*300 UL
¥155,000
Anti Phosphotyrosine,  (Mouse) Horseradish Peroxidase, 27B10.4詳細データ CYT APY03-HRP 1*100 UL
¥120,000
Anti Phosphotyrosine (Trial Size),  (Mouse) Horseradish Peroxidase, 27B10.4詳細データ CYT APY03-HRP-S 1*25 UL
¥38,000
Anti SUMO-2/3,  (Mouse) , 12F3詳細データ CYT ASM23 200 UL
[2 x 100 μl]
¥105,000
Anti SUMO 2/3 (Trial Size),  (Mouse) , 12F3詳細データ CYT ASM23-S 25 UL
[1 x 25 μl]
¥30,000
Anti SUMO-2/3,  (Mouse) , 11G2詳細データ CYT ASM24 2*200 UL
¥107,000
Anti SUMO-2/3 (Trial Size),  (Mouse) , 11G2詳細データ CYT ASM24-S 1*150 UL
¥38,000
Anti SUMO-2/3 Affinity Beads,  (Mouse) , 11G2詳細データ CYT ASM24-BEADS 800 UL
[2 x 400 μl]
¥155,000
Anti Ubiquitin,  (Mouse) , P4D2詳細データ CYT AUB01 2*100 UL
¥105,000
Anti Ubiquitin (Trial size),  (Mouse) , P4D2詳細データ CYT AUB01-S 1*25 UL
¥29,000

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