チロシンリン酸化は Rhoファミリー GTPase 活性を調節する CYTOSKELETON NEWS 2016年5月号

低分子量Gタンパク質の Ras スーパーファミリーには、Ras、Rho、Rab、Arf、Ran などのサブファミリーが含まれ、 幅広く細胞機能を調節することが示されています。GTPase には、不活性型のGDP結合型と、活性型のGTP結合型が存在し、両者の転換により、細胞内のシグナル伝達の分子スイッチとして機能します。Rho サブファミリーには、Rho、Rac、CDC42 が含まれ、主に細胞外増殖因子に応答した細胞骨格の調節に関与すると考えられています。近年の研究では、膜輸送、転写制御、細胞増殖制御、発生などの様々な細胞イベントにおいても、重要な役割を果たしていることが示されています¹。GTPase を介したシグナル伝達の効率は、活性型／非活性型 GTPase の比率に依存します。活性型 GTPase の量は、様々な経路で変化します。（1）グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）によりGDPの解離が促進され、GTPが結合することで活性化が促進される、（2）グアニンヌクレオチド解離阻害因子（GDI）によりGDPの解離が阻害される、（3）GTPase 活性化タンパク質（GAP）によりGTPからGDPへの加水分解が促進され、活性型 GTPase の量が減少する¹（図1）。さらに、Rho GTPase シグナル伝達経路の上流および下流において、チロシンリン酸化などの修飾は重要です。本稿では、Rho サブファミリー GTPase 活性の調節において、チロシンリン酸化の果たす役割について考察します。

Rho GTPase 活性は、Rho GEF により厳密に調節されます。チロシンリン酸化により、RhoGEF （Vav および Dbl）は直接活性化されます。GEFとして知られている Vav、Dbl ファミリーは、両者とも Dbl ホモロジー領域（DH）と Pleckstrin ホモロジー領域（PH）からなる Rho GTPase 結合部位を持っています。不活性状態では閉じた構造をとり、Rho GTPase は DH-PH 結合ドメインに接近することができません。刺激（例：上皮成長因子［EGF］）を受けると、複数のチロシン残基（あるいはセリン／スレオニン残基）が連続的にリン酸化され、自己抑制状態が構造的に緩和されます。その結果、Rho GTPases がこの触媒部位へ結合することが可能になり、基質の GDP から GTP へのヌクレオチド交換が刺激されます^2-4。

Rho GTPase の細胞膜への局在化には、細胞膜に結合したGEFによる活性化と、エフェクタータンパク質の結合が必要です。RhoGDI は、Rho GTPase の細胞質と細胞膜の間の循環に、重要な役割を果たしています。RhoGDI は、細胞質基質の Rho GTPase と複合体を形成し、Rho GTPase が活性化される細胞膜への局在化を妨げます（図1）。恒常的活性化型 Src 非受容体型チロシンキナーゼを発現する細胞では、RhoGDI の Tyr-156 がリン酸化されることで、Rho GTPase との複合体形成能が著しく減少し、その結果として Rho GTPase が細胞膜に局在化し、活性化されて機能します。GTPの加水分解により Rho GTPase が不活性化された後、RhoGDI が非活性化型 Rho GTPase と再結合し、Rho GTPase の細胞質基質へのリサイクルを仲介している可能性があります⁵。

GTPase を介したシグナル伝達の恒常性を維持するために、Rho GAP は、GTPの加水分解を促進することで、活性型 Rho GTPase を不活性型のGDP結合型に変換します。チロシンリン酸化は、Rho GAP 活性に正と負の両方の作用を示します。Sordella らによる研究から⁶、マウス胚線維芽細胞（MEF）での、インスリン様成長因子1（IGF-1）による p190-B RhoGAP の Tyr-306 のリン酸化は、GAP活性に直接影響を与えないことが示されています。その代わりに、p190-B RhoGAP の細胞膜（脂質ラフト）への急速な再分布を引き起こし、細胞膜に局在する活性型 Rho に作用します⁶。Kai らによる別の研究で⁷、EGF刺激による、b2-キメリン（Rac 特異的 GAP） Tyr-21 の Src ファミリーキナーゼを介したリン酸化により、GAP活性が負に調節されることが示されています。そのメカニズムとして、調節タンパク質との結合が促進されるか、Rac GAP の Rac 結合ドメインと活性型 Rac（Pro-23 および Pro-24）との間に立体的な阻害が誘導されることにより、GTPの加水分解を介して Rac を不活性化する能力が低下する可能性が考えられます⁷。

図1　チロシンリン酸化は、Rho ファミリー GTPase の活性化や結合パートナーの調節に重要な役割を果たす。

また、複数の研究で、Rho GTPase が直接チロシンリン酸化されると、本来の局在、活性、結合パートナーが調節されることが示されています。EGFは、Cdc42 のリン酸化と、Vav2 を介した活性化を刺激します。EGFを介した Cdc42 の Tyr-64 のリン酸化は、Src チロシンキナーゼにより仲介され、活性型 Cdc42 と RhoGDI との結合を亢進させます。興味深いことに、Cdc42 のリン酸化は、Cdc42 の活性化や、エフェクターとの相互作用には必要ありません。活性型 Cdc42 は、RhoGDI と結合すると細胞膜から放出され、細胞内の別の場所への移動が促進されます。その場所で、異なるターゲット／エフェクターと結合し、重要な細胞の形質転換イベントを制御している可能性があります⁸。また、Rac1 も、in vitro において、Src および FAK により Tyr-64 がリン酸化されます。Rac1-Y64D（リン酸化を模倣したコンストラクト）を過剰発現させた結果から、Rac1 の Tyr-64 のリン酸化は、細胞の伸展、接着班への局在、GTP・RhoGDI・GEF・エフェクタータンパク質 PAK との結合を負に制御することが示唆されます⁹。非定型 Rho ファミリー GTPase である Wrch-1/RhoU についての研究では、C末端の membrane targeting domain の Tyr-254 が Src を介してリン酸化されると、Wrch-1 が GTP/GDP 結合の変化を介して細胞膜から細胞内膜へ再局在化し、エフェクタータンパク質であるPAKをリクルートして活性化する能力が低下することが示されています¹⁰。

Rho GTPase は、Rho GEF、Rho GAP、RhoGDI によって厳密に調節されており、多くの重要な細胞イベントの分子スイッチとして機能します。さらに、Rho GTPase シグナル伝達カスケードでは、タンパク質のユビキチン化・SUMO化・リン酸化・アセチル化などの翻訳後修飾により、Rho GTPase の機能や局在が効果的に微調整されています。Cytoskeleton社では、目的のタンパク質が様々な修飾によりどのように調節されているかを研究するためにご使用いただける、Signal Seeker™ パスウェイツールキットシリーズを開発しました。独自の溶解バッファーにより、同じライセートサンプルから、異なる翻訳後修飾を受けたタンパク質を濃縮することができ、ターゲットタンパク質の様々な修飾による相互作用の研究を簡単に行うことが可能になりました。

■ CYTOSKELETON NEWS バックナンバー

• 2020年10月号　紡錘体 - 可視化に向けた新規ツール
• 2020年8月号　細胞膜染色用蛍光プローブ
• 2020年4月号　生細胞におけるF-アクチンプローブ
• 2020年3月号　コロナウイルスと細胞骨格
• 2020年2月号　タウ（Tau）の将来性をMapping
• 2020年1月号　Rho GTPaseによる細胞遊走制御

• 2019年12月号　表現型プロファイリング：アクチンに焦点を当てたがん治療
• 2019年11月号　チューブリンの過剰グルタミル化、ミトコンドリア、神経変性
• 2019年9月号　細胞運動性を制御するために相互作用する膜張力とアクチン細胞骨格
• 2019年8月号　Rac1B、がん、およびRac1
• 2019年7月号　Rhoファミリー GTPases、神経可塑性、およびうつ状態
• 2019年6月号　アクチンメチオニン酸化： 動的制御の次の段階
• 2019年5月号　ミクログリアと神経変性疾患
• 2019年2月号　生細胞画像化に対するCNS疾患や障害

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