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研究用

Sos/K-Ras 結合を介して Ras シグナル伝達を制御する新しい低分子阻害剤 CYTOSKELETON NEWS 2014年7月号

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CYTOSKELETON NEWS 2014年7月号 Sos/K-Ras 結合を介して Ras シグナル伝達を制御する新しい低分子阻害剤

Sos/K-Ras 結合を介して Ras シグナル伝達を制御する新しい低分子阻害剤

低分子量Gタンパク質 Ras は、不活性型(GDP 結合型)と活性型(GTP 結合型)の間を行き来する GTPase です。Ras は、正常な細胞増殖や分化に関与するシグナル伝達経路において、重要な役割を果たしています1。Ras の3つのアイソフォームである H-Ras、N-Ras、K-Ras は、ヒト腫瘍において発癌作用を示す遺伝子として、30年以上前に同定されました1,2。Ras シグナル伝達の異常は、30% 以上のヒト癌で確認され、肺癌、大腸癌、膵臓癌に多く認められます1,3。特に K-Ras は、癌研究において最も重要な Ras タンパク質であると考えられており、21% 以上のヒト癌に関与しています4。広範囲にわたる研究がなされているにも関わらず、効果的な Ras 阻害剤が同定されていないことから、K-Ras をターゲットとした新薬の開発は非常に困難であると考えられています。現在のところ、グアニンヌクレオチド交換因子である Sos (Son of sevenless)タンパク質の上流をターゲットにした、Ras タンパク質の治療用阻害剤の開発が期待されています。Sos には、2つのヒトアイソフォーム Sos1 と Sos2 がありますが、Sos1 にフォーカスした研究がほとんどです。しかし、すべての論文で Sos1/ Sos2 を介するシグナル伝達が区別されているわけではなく、まとめて「Sos」とされています。非定型 Ras シグナル伝達を制御する薬剤ターゲットの同定について、これまでに得られた知見を紹介します。

 

Ras を介するシグナル伝達は、一般的に、受容体チロシンキナーゼ(RTK)-Sos-Ras 経路を通じて行われます。増殖因子リガンドが結合すると、膜貫通型 RTK の二量体化及び自己リン酸化が起こります。Sos1 は、増殖因子受容体結合タンパク質2(Grb2)と恒常的に相互作用しています。Sos1/Grb2 複合体は、リン酸化 RTK にリクルートされ、Grb2 の Src homology 2 (SH2) ドメインを介して結合します5-9。RTK/Grb2/Sos1 複合体を形成した Sos は、細胞膜(及び細胞内膜)に位置する不活性型(GDP 結合型)Ras に結合します5。Sos が Ras に結合すると、GDP から GTP への変換が促進され、Ras が活性化されます。活性型である GTP 結合型 Ras は、GTPase 活性化タンパク質(GAPs) を介して、不活性型である GDP 結合型に戻ります(図1)1,6

CYTN201407_2.jpg
図1 RTK-Grb2-Sos-Ras 経路を介した Ras の活性化

 

Sos-Ras 相互作用について報告されたのは 20 年前ですが7、最近の研究から、新しい結合ポケット、低分子量化合物、重要な翻訳後修飾が同定され、Sos-Ras 結合の阻害によって作用する、新しい Ras 阻害剤の開発につながることが期待されています。近年発表された4つの論文で、 Sos-Ras 相互作用を変化させたことで生じる興味深い結果が報告されています。
(1)ペプチド HBS3 (水素結合サロゲート[HBS]により合成)は Sos のαへリックスを模倣するように設計されており、Sos-Ras 結合時に Ras のスイッチ領域に挿入されます。in vitro の実験では、Sos-Ras 結合が阻害され、Ras の活性化が有意に低下しました10
(2)Ras のスイッチ I/II 領域の間に、ユニークなリガンド結合ポケットが同定されました。フラグメントベースドリードディスカバリー(Fragment-Based Lead Discovery [FBLD])により設計された低分子量化合物 DCAI は、このポケットに特異的に結合し、Sos-1 と K-Ras 間の相互作用を防ぐことで K-Ras を阻害します11
(3)Grb2 のリンカー領域内に位置する Lysine 56 の SUMO化は、Sos1/Grb2 複合体の形成を促進し、おそらく Ras を介すると想定される ERK/MAPK 活性化につながります。反対に、Grb2 の Lysine 56 の SUMO化を阻害すると、Sos1-Grb2 結合が妨げられます12
(4)K-Ras は、翻訳後修飾として Lysine 104 がアセチル化されると、Sos1を介するヌクレオチド交換が阻害され、負に調節されます。アセチルトランスフェラーゼの活性化又は脱アセチル化酵素の阻害を介して、K-Ras のアセチル化を調節することで、癌の治療につながる可能性があります13

 

治療用の K-Ras 阻害剤は、K-Ras 変異体を選択的に阻害することが理想です。変異体と野生型の選択は、変異がエフェクター結合部位から遠位にあるため、困難であることが示されています1。K-Ras の 1アミノ酸残基の変異(12、13、61)は良く知られており、この変異によって K-Ras は恒常的活性化型(GTP 結合)GTPase となります4。 近年、Kevan Shokat 博士の研究グループ(サンフランシスコ カリフォルニア大学 ハワード・ヒューズ医療研究所)が、肺癌患者の 7% に存在する特定の K-Ras 変異体(G12C; グリシン 12 がシステインに置換)で、新しいアロステリックな スイッチ II ポケット(S-IIP)を同定したことで、変異体の選択に関する問題に進展が見られました14。システイン変異に結合し、スイッチ I 及びスイッチ II 領域の機能を阻害する低分子化合物を設計しました。その結果、Sos を介するヌクレオチド交換が妨げられ、K-Ras 変異体の選択的な阻害に成功しています。

 

Ras の調節機構が明らかになるにつれて、GTPase タンパク質の活性化レベルを高感度で定量的に測定する方法が、ますます重要になっています。サイトスケルトン社では、低分子量Gタンパク質の活性化レベルを広く測定できる、プルダウン法や G-LISA 活性化アッセイなどの、多くの低分子量Gタンパク質ツールを提供しています。プルダウン法は、ビーズに結合したエフェクタータンパク質のドメインを利用して、活性化 GTPase のレベルを測定し、ウエスタンブロットでタンパク質の活性化レベルを測定します。G-LISA 活性化アッセイは、迅速・高感度で、従来のプルダウン法より定量性に優れています。また、Ras 活性化経路の解明に使用できる、低分子量Gタンパク質抗体、活性化剤、阻害剤を提供しています。

参考文献

1. Wang W. et al. 2012. Ras inhibition via direct Ras binding—is there a path forward. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 5766-5776.
2. Castellano E. and Santos E. 2011.  Functional specificity of Ras isoform: so similar but so different. Genes Cancer.2, 216-231.
3. Burns M.C. et al. 2014. Approach for targeting Ras with small molecules that activate SOS-mediated nucleotide exchange. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 3401-3406.
4. Baines A. et al. 2011. Inhibition of Ras for cancer treatment: the search continues.  Future Med. Chem3, 1787-1808.
5. McKay M.M. and Morrison D.K. 2007. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene26, 3113-3121.
6. Innocenti M. et al. 2002. Mechanisms through which sos1 coordinates the activation of Ras and Rac. J. Cell Biol.156, 125-136.
7. Bar-Sagi D. 1994. The Sos (Son of sevenless) protein. Trends Endocrinol. Metab5, 165-169.
8. Ceresa B.P. and Pessin J.E. 1998. Insulin regulation of the Ras activation/inactivation cycle. Mol. Cell. Biochem.182, 23-29.
9. Lowenstein E.J. et al. 1992. The SH2 and SH3 domain-containing protein GRB2 links receptor tyrosine kinases to ras signaling. Cell70, 431-442.
10. Patgiri A. et al. 2012. An orthosteric inhibitor of the Ras-Sos interaction. Nat. Chem. Biol7, 585-587.
11. Maurer T. et al. 2012. Small-molecule ligands bind to a distinct pocket in Ras and inhibit SOS-mediated nucleotide exchange activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 5299-5304.
12. Qu Y. et al. 2014. SUMOylation of Grb2 enhances the ERK activity by increasing its binding with Sos1. Mol. Cancer.13, 95
13. Yang M.H. et al. 2012. Regulation of RAS oncogenicity by acetylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A109, 10843-10848.
14. Ostrem J. et al. 2013. K-Ras (G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions. Nature.503, 548-551.

Ras / Sos 製品

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti Acetyl Lysine,  (Mouse) , 3C6.08.20詳細データ CYT AAC01 200 UL
[2 x 100 μl]
¥105,000
SOS1 Ras GEF protein, Human詳細データ CYT CS-SOS1-B 1 MG
[1 x 1 mg]
販売終了
Raf protein ras binding domain on GST beads, Mouse詳細データ CYT RF02-A 1*2 MG
¥141,000
Raf protein ras binding domain on GST beads, Mouse詳細データ CYT RF02-B 4*2 MG
お問い合わせ
RhoGEF Exchange Assay詳細データ CYT BK100 1 KIT
[60-300 assays]
¥197,000

G-Switch アクチベーター/インヒビター

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-A 1*20 UG
¥61,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-B 5*20 UG
¥182,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based) Clostridium botulinum , Unlabeled詳細データ CYT CT04-C 20*20 UG
お問い合わせ
Rho Activator II詳細データ CYT CN03-A 3*20 UG
¥61,000
Rho Activator II詳細データ CYT CN03-B 9*20 UG
¥170,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I詳細データ CYT CN04-A 3*20 UG
¥61,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I詳細データ CYT CN04-B 9*20 UG
¥170,000

低分子量Gタンパク質活性化アッセイ/キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Ras Activation Assay Biochem Kit詳細データ CYT BK008-S 1 KIT
[20 assays]
¥108,000
Ras Activation Assay Biochem Kit詳細データ CYT BK008 1 KIT
[50 assays]
¥212,000
RhoA Pulldown Activation Assay Kit詳細データ CYT BK036-S 1 KIT
[20 assays]
¥108,000
RhoA Pulldown Activation Assay Kit詳細データ CYT BK036 1 KIT
[80 assays]
¥212,000
Rac1 Pulldown Activation Assay Kit詳細データ CYT BK035-S 1 KIT
[20 assays]
¥108,000
Rac1 Pulldown Activation Assay Kit詳細データ CYT BK035 1 KIT
[50 assays]
¥212,000
Cdc42 Pulldown Activation Assay Kit詳細データ CYT BK034-S 1 KIT
[20 assays]
¥108,000
Cdc42 Pulldown Activation Assay Kit詳細データ CYT BK034 1 KIT
[50 assays]
¥212,000
Ras G-LISA(R) Activation Assay Kit詳細データ CYT BK131 1 KIT
[96 assays]
¥264,000
RhoA G-LISA(R) Activation Assay (absorbance)詳細データ CYT BK124 96 ASSAY
¥264,000
Rac1 G-LISA(R) Activation Assay Kit詳細データ CYT BK128 1 KIT
[96 assays]
¥264,000
Cdc42 G-LISA(R) Activation Assay Kit詳細データ CYT BK127 96 ASSAY
¥264,000

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