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研究用

ミオシンのアセチル化はサルコメアの構造と機能を調節する CYTOSKELETON NEWS 2014年5月号

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CYTOSKELETON NEWS 2014年5月号 ミオシンのアセチル化はサルコメアの構造と機能を調節する

ミオシンのアセチル化はサルコメアの構造と機能を調節する

サルコメア複合体は、カルシウム感受性で、筋細胞において機械化学的な変換ユニットとして重要な役割を果たしています。ミオシン、アクチン、トロポミオシン、3種類のトロポニンを含みます。そのうちの1つであるトロポニンCは、カルシウムが結合すると、ミオシンとF-アクチンの結合を促進します。サルコメアの機能を制御しているカルシウムレベルは、筋小胞体の RyR2 受容体チャネルで発生する電気信号によって起こる、カルシウム流入によって変動します1。他に、サルコメアの構成要素をリン酸化する、ミオシン軽鎖キナーゼ[MLCK]、ミオシン軽鎖2[MLC2]、cAMP依存性プロテインキナーゼ[PKA]などのキナーゼによっても制御されています2,3。近年は、アセチル化、メチル化、酸化、ユビキチン化などによる調節も報告されています4,5。前臨床研究や肥大性心疾患の治療に、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤が使用されていること6,7や、正しくサルコメアが機能するためには、ミオシンのアセチル化されたアミノ酸が重要であるという報告8,9から、近年、アセチル化がさらに重要であると考えられています。

Mahesh Gupta の研究グループは、心機能における HDAC 阻害剤の研究を通して、サルコメアの機能にアセチル化が重要であることを示しました。報告によると、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT; p300/CBP-associated factor [PCAF])と HDAC(HDAC4)の両方がサルコメアマトリックスに局在し、HDAC 阻害剤で処理した筋フィラメントでは力発生が増加します8。2011年には、別の HDAC(HDAC3)も心臓のサルコメアに結合していることを示しました9。また、広範に認識する抗アセチル化抗体を使用して、アセチル化タンパク質の一つがミオシンであることを示しました。近年、Foster ら10が、ブタ心臓タンパク質の初期アセチル化タンパク質を解析した結果、240 のタンパク質中 994のリジン残基が修飾され、ミオシンの多くのリジン残基がアセチル化されていたと報告しました。実際、49 のアセチル化リジン残基を持つミオシンは、最もアセチル化されているタンパク質です10。ミオシンのリジン残基は、コイルドコイル、ヒンジ領域およびアクチン結合部位でアセチル化されています(図1参照)。

 

CYTN201405_2.jpg

図1 ミオシン構造略図および報告されているアセチル化部位
Foster ら10が発見したリジン残基を黄色、Samant ら9を緑色で示す。アセチル化は、アクチンやATPの結合部位からヒンジ領域・コイルドコイルまで、ミオシンの重要な機能領域の全てをカバーしている。

 

ミオシンは、心筋細胞におけるアセチル化のターゲットとして特出しており、多くの研究グループによって生化学的および機能的な研究が行われています。In vitro において、PCAF HAT を用いてミオシンをアセチル化すると、2つのリジン残基(K549 と K633)がアセチル化されることが明らかとなりました。どちらも頭部ドメイン内で、アクチン結合部位(K549)または力発生に関わるヒンジ領域(K633)に隣接しており、ミオシンの重要な機能に影響を与える位置に配置されています9。K549 の修飾は、in vivo のサンプルにおいても確認されましたが、K633 の修飾は、in vivo では検出されませんでした。in vitro で、修飾されたミオシンを調製して酵素反応解析を行うと、Km(ミカエリス定数)は 30% 低下、アクチンフィラメントの運動性は 20-36% 増加しており、in vivo における機能的な活性に、かなり影響を与えている可能性があります。このような実験では、酵素反応速度論や、特異的に修飾されたアミノ酸部位の定量的な測定について、より詳細な解析が求められます。

心臓ストレス/機能障害モデル(大動脈狭窄・6週間)において、ミオシンのアセチル化はコントロールの10倍以上に増加することが示されています9。また、イソプロテレノール(肥大アゴニスト)を使用した実験では、ストレスによるアイソフォーム発現の変化や肥大に先立って、アセチル化が3日間で30%増加しました。これらの結果は、ミオシンのアセチル化が急速に起こり、機械的に効率を向上させるような変化を引き起こすことを示唆しています。

興味深いことに、Foster ら10による全体のアセチル化タンパク質を検出する方法や、他のグループがそれぞれ異なる組織を用いて行った方法などからは、Gupta 博士の研究室が報告した2つのアセチル化リジンは検出されませんでした。これは広範なアセチル化研究においては一般的で、異なる報告から検出されたアセチル化ペプチドが有意に重複している(30-60%)こともあれば、重要な新発見があることもあります。このことは、おそらく新たな研究分野や異なる方法論を採用した結果であると考えられますが、まだ全ては解明されていません。アセチル化の割合を決定すること、広範で特異的な配列を認識する新しい抗体、特定のアミノ酸を特異的にアセチル化する技術などは、今後の実験や方法論の構築に役立つと考えられます。

Cytoskeleton 社では、アセチル化研究に役立つ新しいモノクローナル抗体(品番: AAC01)を販売しています。他の抗アセチル化抗体に比べてユニークな配列を認識し、アセチル化ミオシンを簡単に検出することが可能です。

参考文献

1. Song L.S. et al. 2005. Calcium biology of the transverse tubules in heart. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1047, 99-111.
2. Seguchi O. et al. 2007. A cardiac myosin light chain kinase regulates sarcomere assembly in the vertebrate heart. J. Clin. Invest. 117, 2812-24.
3. Sumandea C.A. 2011. Cardiac troponin T, a sarcomeric AKAP, tethers protein kinase A at the myofilaments. J. Biol. Chem. 286, 530-541.
4. Cui Z. et al. 2013. Regulation of cardiac proteasomes by ubiquitination, SUMOylation, and beyond. J. Mol. Cell Cardiol. doi: 10.1016/j.yjmcc.2013.10.008.
5. Terman J.R. and Kashina A. 2013. Post-translational modification and regulation of actin. Curr. Opin. Cell Biol. 25, 30-38.
6. Ling S. et al. 2012. CKIP-1 inhibits cardiac hypertrophy by regulating class II histone deacetylase phosphorylation through recruiting PP2A. Circulation. 126, 3028-40.
7. Kook H. et al. 2003. Cardiac hypertrophy and histone deacetylase-dependent transcriptional repression mediated by the atypical homeodomain protein Hop. J. Clin. Invest. 112, 863-71.
8. Gupta M.P. et al. 2008. HDAC4 and PCAF bind to cardiac sarcomeres and play a role in regulating myofilament contractile activity. J. Biol. Chem. 283, 10135-10146.
9. Samant S.A. et al. 2011. HDAC-3 dependent reversible lysine acetylation of cardiac myosin heavy chain isoforms modulates their enzymatic and motor activity. J. Biol. Chem. 286, 5567-5577.
10. Foster D.B. et al. 2013. The cardiac acetyl-lysine proteome. PLoS One. 8, e67513.

抗アセチル化リジン抗体

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti Acetyl Lysine,  (Mouse) , 3C6.08.20詳細データ CYT AAC01 200 UL
[2 x 100 μl]
¥105,000

ミオシン/アクチン キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
F-Actin Visualization Biochem Kit詳細データ CYT BK005 1 KIT
[300 slides]
¥114,000
G-Actin : F-Actin In Vivo Assay Kit, Mouse詳細データ CYT BK037 1 KIT
[30-100 assays]
¥211,000
Actin Binding Protein Spin-down Biochem Kit (for muscle)詳細データ CYT BK001 1 KIT
[30-100 assays]
¥220,000
Actin Binding Protein Spin-Down Biochem Kit (Non-muscle)詳細データ CYT BK013 1 KIT
[30-100 assays]
¥224,000
Actin Polymerization Biochem Kit, Rabbit詳細データ CYT BK003 1 KIT
[30-100 assays]
¥251,000
F-Actin Visualization Biochem Kit詳細データ CYT BK005 1 KIT
[300 slides]
¥114,000
ATPase ELIPATM (Enzyme Linked Inorganic Phosphate Assay)詳細データ CYT BK051 1 KIT
[96 assays]
¥102,000
CytoPhosTM Phosphate Assay (1-500ug/ml protein reactions)詳細データ CYT BK054 1 KIT
[1000 assays]
¥102,000
GTPase ELIPATM (Enzyme Linked Inorganic Phosphate Assay)詳細データ CYT BK052 1 KIT
[96 assays]
¥102,000
Kinesin ELIPA詳細データ CYT BK060 1 KIT
[96 assays]
¥228,000
HTS Kinesin ATPase Endpoint Assay詳細データ CYT BK053 1 KIT
[1000 assays]
¥236,000

ミオシン/アクチン タンパク質

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Actin protein (rabbit skeletal muscle, >99% pure), Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT AKL99-A 4*250 UG
¥58,000
Actin protein (rabbit skeletal muscle, >99% pure), Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT AKL99-C 5*1 MG
¥139,000
Actin Protein (skeletal muscle, >95% pure), Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT AKL95-B 1*1 MG
¥28,000
Actin Protein (skeletal muscle, >95% pure), Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT AKL95-C 5*1 MG
¥111,000
Actin Protein (cardiac muscle, >99% pure), Bovine, Unlabeled詳細データ CYT AD99-A 1*1 MG
¥36,000
Actin Protein (cardiac muscle, >99% pure), Bovine, Unlabeled詳細データ CYT AD99-B 5*1 MG
¥148,000
Actin Protein, smooth muscle, >99% pure詳細データ CYT AS99-A 1*1 MG
¥36,000
Actin Protein, smooth muscle, >99% pure詳細データ CYT AS99-B 5*1 MG
¥148,000
Actin Protein (platelet non-muscle, >99% pure), Human, Unlabeled詳細データ CYT APHL99-A 2*250 UG
¥64,000
Actin Protein (platelet non-muscle, >99% pure), Human, Unlabeled詳細データ CYT APHL99-E 5*1 MG
お問い合わせ
Pre-formed actin filaments (rabbit skeletal muscle), Rabbit詳細データ CYT AKF99-A 1*1 MG
¥55,000
Pre-formed actin filaments (rabbit skeletal muscle), Rabbit詳細データ CYT AKF99-B 5*1 MG
¥196,000
Lyophilized Thin Filaments, Bovine詳細データ CYT CS-TFC01 1 MG
[1 x 1 mg]
販売終了
Cardiac Myosin S1, Bovine詳細データ CYT CS-MYS03 1*250 UG
¥92,000
Skeletal Muscle Myosin S1, Rabbit詳細データ CYT CS-MYS04 1*250 UG
¥92,000
Myosin S1 Fragment (smooth), Chicken詳細データ CYT CS-MYS05 1*250 UG
¥92,000
Myosin Skeletal Muscle, Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT MY02-A 5*1 MG
¥92,000
Myosin Skeletal Muscle, Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT MY02-B 20*1 MG
¥267,000
Myosin Cardiac Muscle詳細データ CYT MY03-A 5*1 MG
¥92,000
Myosin Cardiac Muscle詳細データ CYT MY03-B 20*1 MG
¥267,000
Myosin: Heavy Meromyosin, Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT MH01-A 4*50 UG
¥81,000
Tropomyosin/Troponin Complex, Bovine詳細データ CYT CS-TT05 1 MG
[1 x 1 mg]
¥87,000

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