生細胞におけるF-アクチンプローブ CYTOSKELETON NEWS 2020年4月号

アクチン細胞骨格の動的なリモデリング（例：線維状アクチン（F-アクチン）と単量体アクチン（G-アクチン）間の迅速な循環）は、細胞内輸送、細胞増殖、形態、運動性、輸送、極性、細胞間接触、および細胞質分裂といった複数の生理学的機能に必須です ^{1, 2)}。同様に、アクチン細胞骨格動態の機能不全は、発がん性、神経変性、または心血管系由来をはじめとする数々のヒト疾患の病態生理学的特徴です ³⁻⁹⁾。このような理由から、健常または疾患の細胞培養モデルにおけるアクチン細胞骨格動態を研究するためにF-アクチン生細胞イメージングプローブへの関心が続いています（表1）。

高感度かつ選択的にF-アクチンに結合できる一方で、アクチンのリモデリングを阻害しない小分子が理想的なアクチン可視化ツールとされています。さらに、トランスフェクションやエレクトロボレーションを必要とせずに培養細胞や組織に直接導入できることが、より都合がよいとされています ^10-13)。新規のSiR/SPYアクチンプローブは既存のアクチンプローブにおける懸念や欠点を克服しつつ、「理想的な」アクチン結合分子のニーズを満たしています（表1、図1、2）。2014年に市販されたSiRとSiR700-アクチン生細胞イメージングプローブは、Lukinaviciusら ^{12, 13)} によって最初に提案され、標識アクチンタンパク質やアクチン結合タンパク質のトランスフェクションや過剰発現を必要とせずに内在性のF-アクチンを標識します ^{12, 13)} 。SiR/SiR700-アクチンプローブは、構造的に天然に存在するF-アクチン結合分子ジャスプラキノリド（jasplakinolide）に類似しています ^{12, 13)}。これらのF-アクチンプローブは明るく光安定性に優れた近赤外色素であり、ほとんどバックグラウンドのない、独自のフルオロフォアシリコンローダミン（SiR）を利用しています（図1、2）。SiRプローブは非蛍光性、閉環のオフ状態（スピロラクトン：spirolactone）で存在するため、プローブはF-アクチンから乖離すると自己消光されます ^{12, 13)}（図3）。SiRプローブは、広範囲で遺伝的にコードされたレポーター蛍光色素（例：GFP、ｍCherry）と互換性のある標準的なCy5設定（至適励起: 650nm、蛍光：670nm）で可視化することができます ^{12, 13)}。SPY555-アクチンは、F-アクチン生細胞イメージングプローブのSpirochromeシリーズに新たに追加されました。SPY555-アクチンはSiRアクチンプローブの改良版であり、より低濃度で使用できることから頑強に標識することができ、また細胞毒性やアクチン細胞骨格ダイナミクスの摂動も低減されます。SPY555-アクチンは、SiR/SiR700-アクチンと同じ染色プロトコールを用いて標準的なTMRやCy3チャネル（最適励起: 555 nm、蛍光: 580nm）でイメージングできます。SiRとSPYアクチンプローブの主な特長は、細胞透過性、蛍光発生的特性、最小限の細胞毒性、光安定性、および標準的な蛍光顕微鏡（例えば、広視野、共焦点）と超解像顕微鏡（例えば、STED、SIM）の両方に対応することがあげられます ^12-18)（図1、2）。STEDとSiR/SPY-アクチンプローブとを組み合わせて使用することで、細胞内のF-アクチン構造の比類のない蛍光可視化と生細胞に内でのそれらの物理的特性の評価を可能にします ^14-18)（図1、2）。SiR-アクチンプローブは、組織内 ¹⁹⁾ やヒトiPS細胞株、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、複数のがん細胞、および初代ニューロンといったさまざまな細胞種のF-アクチンの検討に使用されています ^{14, 16-18, 20-22)}（図1、2）。

図1. マトリゲル（3D培養）内でH2B-GFP（青色）を発現するMCF10A細胞をSiR-アクチン（赤色）で染色した。画像は倒立LSM顕微鏡で撮影した。
Christian Conrad と Katharina Jechow, Heidelbergよりご提供頂いた。

図2. SPY505 またはSPY555で染色したDNA、アクチン、およびチューブリン。
写真はスピノクロムウェブサイトの表紙ページのものである。

図3. 蛍光双生イオン（開放）型（左の構造）と非蛍光スピロ（閉鎖）型（右の構造）との間で平衡状態で存在するSiR誘導体。

生細胞のアクチン動態に関する最初の研究は、アクチンタンパク質の蛍光誘導体を細胞に微量注入して行われました ^{50, 51)}。これは非常に効率的な手法ですが、装置の設定に時間を要することから、次第にGFP-アクチン抱合体をトランスフェクションする方法がより一般的になりました。蛍光標識したアクチンタンパク質やGFP/eGFP-アクチンは光褪色後蛍光回復法（FRAP）で良好に作用した ^{11, 23-25)} ことから、アクチン細胞骨格再編成の動的性質が示されました。しかし、GFP/eGFP-アクチンにはいくつかの欠点があります ¹⁰⁾。第一に、GFPは分子量大きい（〜28 kDa）ため、重合化を阻害する場合があり ²⁶⁾、GFP-アクチンがF-アクチン構造を特異的に標識する可能性があります ^{10, 24)}。第二に、いくつかのアクチン結合タンパク質（例：フォルミンファミリー核形成促進因子）は、GFP-アクチンがアクチンシードや成長する重合体への組み込みを立体的に阻害する可能性があります ^{27, 28)}。第三に、非フィラメント状蛍光アクチンから比較的高いバックグラウンドシグナルがみられることです ²⁹⁾。最後に、eGFP-アクチンの発現が細胞の挙動に影響を及ぼすことがあります ^{30, 31)}。

その他のアクチン生細胞イメージングの方法として、酵母やヒト由来アクチン結合ドメインをGFP、eGFP、またはm-Cherryフルオロフォアに結合させて使用する場合があります ^{10, 11, 32)}。遺伝的にコードされたF-アクチンプローブで最も一般的なのは、Lifeact、ユートロフィン(UtrCH)、およびF-tractinです ¹⁰⁾。Lifeactは酵母Abp140由来の17アミノ酸からなるペプチド ^{33, 34)}で、哺乳動物細胞や非哺乳動物細胞における生細胞イメージングに使用されています ^{24, 34-36)}。Lifeactには、アクチン動態に影響を及ぼす可能性（Lifeact-induced artifactと呼ばれる）や、コフィリンなどのアクチン関連タンパク質の結合を阻害する可能性などいくつかの欠点があります ^{32, 37-40)}。Lifeact-GFPはF-アクチンに強力に結合（Kd, 2.2 ± 0.3 μM）するものの、そのG-アクチンへの結合親和性は10倍高いため、バックグラウンドの蛍光が高くなります。Lifeactはすべてのアクチンをふくむ構造に結合するわけではありません ^{10, 38)}。Lifeactは、SiR/SiR700/SPY プローブのように単に培地に添加するのではなく、トランスフェクションにより細胞に導入されます。UtrCHはutrophinのタンデムカルポニン相同性ドメイン（CH1とCH2）に基づいており ⁴¹⁾、アクチン結合タンパク質であるヒトutrophinの最初の261アミノ酸残基から構成されています ⁴²⁾。CHドメインはアクチンにKd = 〜18 μMで結合します ⁴³⁾。utrophinベースのプローブは広範な細胞や生物種にわたり使用されています ^{10, 32)}。Lifeactと同様に、utrophinベースのプローブは高濃度ではアクチン細胞骨格動態に対して有害な影響を示します ^{32, 37, 44)}。F-tractinは、ラットのアクチン結合イノシトール1,4,5-三リン酸3-キナーゼAに由来する43アミノ酸からなるペプチドであり、F-アクチンにKd = 〜10 μMで結合します ^{45, 46)}。F-tractinは（他のプローブと比較して）よりサイズが大きいことから、重合化の調節や促進するアクチン結合タンパク質の結合を立体的に妨げる可能性 ¹⁰⁾ や、アクチンベースの細胞構造を修飾する可能性があります ³²⁾。

生細内のアクチン動態をモニタリングする2つの新規技術として、(1) ナノボディと呼ばれる単一ドメイン抗体 ⁵²⁾ と、(2) アクチン“アフィマー”と呼ばれるファージライブラリスクリーニングで単離された合成アクチン結合タンパク質 ^47-49) があります。ナノボディは、もし正確に開発されなければG-アクチン結合による高いバックグラウンドシグナルを示す可能性があります ¹⁰⁾。近年、F-アクチンへの低μM結合親和性をもつ3種のeGFP-融合アクチンアフィマーが報告されました ⁴⁷⁾ が、FRAP顕微鏡によりeGFP-アフィマーはアクチンフィラメントのサブセットに優先的に結合し、細胞内のアクチン構成を変化する可能性があることが示唆されました。

生細胞におけるF-アクチンベースの構造を可視化するには複数の選択肢があるものの、完全に機能する生細胞プローブはありません（表1）。理想的には、高感度、選択的、蛍光発生的、バックグラウンドシグナルが低い、非毒性、かつ複数生物種の広範な細胞に容易に導入できるF-アクチンプローブが最善です。アクチン細胞骨格動態/構造機構の変化が生理学的に適切でありプローブ自体によるアーチファクトではないことを確認することが非常に重要です。研究者の方々がF-アクチン生細胞イメージング研究を行う際のお役に立てるよう、Cytoskeleton社ではSiRとSPYアクチン生細胞画像化プローブを提供しています。

■ CYTOSKELETON NEWS バックナンバー

• 2020年10月号　紡錘体 - 可視化に向けた新規ツール
• 2020年8月号　細胞膜染色用蛍光プローブ
• 2020年4月号　生細胞におけるF-アクチンプローブ
• 2020年3月号　コロナウイルスと細胞骨格
• 2020年2月号　タウ（Tau）の将来性をMapping
• 2020年1月号　Rho GTPaseによる細胞遊走制御

• 2019年12月号　表現型プロファイリング：アクチンに焦点を当てたがん治療
• 2019年11月号　チューブリンの過剰グルタミル化、ミトコンドリア、神経変性
• 2019年9月号　細胞運動性を制御するために相互作用する膜張力とアクチン細胞骨格
• 2019年8月号　Rac1B、がん、およびRac1
• 2019年7月号　Rhoファミリー GTPases、神経可塑性、およびうつ状態
• 2019年6月号　アクチンメチオニン酸化： 動的制御の次の段階
• 2019年5月号　ミクログリアと神経変性疾患
• 2019年2月号　生細胞画像化に対するCNS疾患や障害

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