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有糸分裂制御タンパク質におけるSUMO化の重要性 CYTOSKELETON NEWS 2015年6月号

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CYTOSKELETON NEWS 2015年6月号 有糸分裂に関わるタンパク質のSUMO化: 局在と機能

有糸分裂に関わるタンパク質のSUMO化: 局在と機能

はじめに

有糸分裂が正常に行われるためには、無数のタンパク質の精巧な調節と相互作用が必要となります。近年、翻訳後修飾(PTM)の一つであるSUMO化が、有糸分裂の制御に関わるタンパク質の機能調節において重要な役割を担っていることが明らかになりました1。SUMO(Small Ubiquitin-like MOdifier)タンパク質は、複数の酵素の働きにより、標的タンパク質のリジン残基に共有結合します2,3。SUMO化された有糸分裂タンパク質は、核内に高密度に局在し、逆反応である脱SUMO化、または、ユビキチンを介したタンパク質分解のいずれかによって量的に調節されると考えられています4,5。3種類のSUMOパラログ(SUMO 1, 2, 3)と SUMO-2/3 は高い相同性を有し、同一のグループに分類されます。SUMO-1 と SUMO-2/3 は、それぞれ標的となるタンパク質が異なり、機能や細胞内局在にも違いが見られます6。有糸分裂における動的なSUMOを介した経路の解析には、SUMOコンジュゲートの正確な識別が非常に重要になります。しかし、以前は高品質なSUMOタンパク質抗体が存在せず、低レベルのコンジュゲートの検出は非常に困難でした。本稿では、SUMO-2/3 による修飾が有糸分裂をどのように調節するかを簡潔に説明し、SUMO-2/3 により修飾されたタンパク質の検出に使用できる新しい抗体をご紹介します。

有糸分裂に関わるタンパク質のSUMO化による調節

SUMO化は、タンパク質の結合モチーフや安定性、輸送を変化させることにより、有糸分裂に関わるタンパク質の機能を動的に調節します。例えば、染色体パッセンジャー複合体(chromosomal passenger complex; CPC)を形成する有糸分裂期キナーゼである Aurora B7 と Borealin8 は、SUMO-2/3 によって修飾されます。Aurora B は、CPC の触媒サブユニットで、SUMO化を受けるとキナーゼ活性が亢進します7。 CPC は、染色体の紡錘体赤道面への整列、紡錘体-動原体結合、細胞質分裂などの有糸分裂イベントを調節します7,8。もう一つの重要な SUMO-2/3 によってSUMO化される有糸分裂タンパク質は、DNAトポイソメラーゼ II です。SUMO化されたトポイソメラーゼは、染色体が適切に分離されるために重要な役割を果たしています9。また、SUMO-2/3 は、動原体に局在するタンパク質である BubR1 および Nuf2 のSUMO化に関与します。これらのタンパク質は、微小管(MT)キネシンモーター分子である CENP-E とポリ SUMO-2/3 との、非共有結合性相互作用に関与すると考えられています。この翻訳後修飾は、モーターが適切に局在化して機能する(MTと動原体との結合など)ために非常に重要です。

図1 間期(A: パネル左)および中期(B: パネル右)における HeLa 細胞の蛍光免疫染色

図1 間期(A: パネル左)および中期(B: パネル右)における HeLa 細胞の蛍光免疫染色。
細胞を、α/β-チューブリン抗体(ヒツジ抗チューブリン抗体、品番: ATN02、緑色)および SUMO-2/3 抗体(クローン 12F3、品番: ASM23、赤色)を用いて染色した。DNAはDAPIを用いて染色した。

有糸分裂における内在性 SUMO-2/3 の検出

SUMOコンジュゲートの発現は低レベルなため、クルードな細胞/組織ライセートからのSUMO化タンパク質の検出は非常に困難です。解析を行うには、ターゲットタンパク質の濃縮が必要となります11。免疫沈降(IP)は、効率的に濃縮できる手法ですが、SUMOタンパク質に特異的に結合する親和性の高い抗体が必要となります。近年、タンデムな SUMO 相互作用モチーフ(SUMO interacting motifs; SIMs)を利用したプルダウンアッセイにより、特異的なターゲットの検出が可能であることが報告されましたが、この方法は一般的ではなく、夾雑物による影響を受ける可能性があります12。最も一般的なのは、エピトープタグを付加したSUMO変異体を発現する細胞株を用いる方法です13。しかし、細胞株の構築には時間と手間がかかり、変異SUMOタンパク質を過剰発現させると、細胞の恒常性を乱す可能性があります。現在では、SUMO-2/3 を認識する高品質な抗体を研究にご利用いただくことが可能です。Cytoskeleton社では、2種類の SUMO-2/3 抗体を開発しました。クローン 12F3(品番: ASM23)は、WB、IF、IP などのアプリケーションにおいて、一般的に使用されているクローン 8A2 よりも優れたパフォーマンスを示します。もう一方のクローン 11G2(品番: ASM24)は、非常に高感度な免疫沈降を可能とします。IF(図1)および IP(図2)実験は、以前に報告された結果と一致しています10,11。大部分の SUMO-2/3 コンジュゲートは、間期に核に大量に局在しますが(図1A)、細胞質タンパク質もSUMO化を受けます(図1A の挿入画像を参照)。細胞が有糸分裂に入ると、数種類のSUMO化タンパク質(例: RanGAP114 および トポイソメラーゼ II9)が、動原体微小管上にはっきりと可視化されます(図1B)。IP によりSUMO化タンパク質を濃縮することで、TFII-I などの特定のターゲットの検出が(低レベルであっても)可能になります。11G2 および 12F3 抗体を用いて、HeLa細胞ライセートから SUMO-2/3 コンジュゲートを沈殿させます。トータルの沈殿物を、抗 SUMO-2/3 抗体(12F3)でイムノブロットし、特定のタンパク質(TFII-I および RanGAP1)をそれぞれに対する抗体で検出しました(図2)。興味深いことに、RanGAP1 は SUMO-111 または SUMO-2/3 のいずれかによってモノSUMO化されます。2種類の抗体を用いて沈殿させた SUMO-2/3 コンジュゲートは、それぞれわずかに異なる特性を示します。12F3 は線状エピトープを認識することが確認されていますが、11G2 はエピトープの立体構造を認識すると考えられます。

図2 11G2 および 12F3 を用いた SUMO-2/3 の免疫沈降

図2 11G2 および 12F3 を用いた SUMO-2/3 の免疫沈降
HS43(43℃ ヒートショック)、CT37(コントロール)、KD S2(SUMO-2 shRNA ノックダウン)から、変性細胞ライセートを調製した15。矢印は抗体の重鎖および軽鎖を、丸印(○)は結合していないフリーのSUMOを示す。

まとめ

PTMにより有糸分裂に関わるタンパク質の機能が微調整されることで、細胞分裂が正常に行われます。PTMの動的な性質を完全に理解するには、基質タンパク質と下流のシグナル伝達カスケードを同定する必要があります。有糸分裂(およびその他の細胞プロセス)におけるPTMを介した調節機構は、その多くがまだ発見されていません。Cytoskeleton社では、SUMO-2/3 によるSUMO化を含む、様々なPTMに特異的な抗体を開発しました。これらの抗体は、新しいPTMターゲットの検出や研究、および、有糸分裂やその他の細胞プロセスにおける調節機構の解析にご利用いただけます。

参考文献
  1. Dasso M. 2008. Emerging roles of the SUMO pathway in mitosis. Cell Div. 3, 5.
  2. Hay R.T. 2005. SUMO: a history of modification. Mol. Cell. 18, 1-12.
  3. Wang Y. et al. 2009. SUMOylation and deSUMOylation at a glance. J. Cell Sci. 122, 4249-4252.
  4. Uzunova K. et al. 2007. Ubiquitin-dependent proteolytic control of SUMO conjugates. J. Biol. Chem. 282, 34167-34175. 
  5. Prudden J. et al. 2007. SUMO-targeted ubiquitin ligases in genome stability. EMBO J. 26, 4089-4101.
  6. Ayaydin F. et al. 2004. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol. Biol. Cell. 15, 5208-5218. 
  7. Ban R. et al. 2011. Mitotic kinase Aurora-B is regulated by SUMO-2/3 conjugation/deconjugation during mitosis.Genes Cells. 16, 652-669.
  8. Klein U.R. et al. 2009. RanBP2 and SENP3 function in a mitotic SUMO2/3 conjugation-deconjugation cycle on Borealin. Mol. Biol. Cell. 20, 410-418.
  9. Azuma Y. et al. 2003. SUMO-2/3 regulates topoisomerase II in mitosis. J. Cell Biol. 163, 477-487.
  10. Zhang X.D. et al. 2008. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Mol. Cell. 29, 729-41.
  11. Becker J. et al. 2013. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nat. Struct. Mol. Biol.20, 525-31. 
  12. Da Silva-Ferrada E. et al. 2013. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Sci. Rep. 3, 1690.
  13. Rosas-Acosta et al. 2005. A universal strategy for proteomic studies of SUMO and other ubiquitin-like modifiers.Mol. Cell Proteomics. 4, 56-72. 
  14. Joseph J. et al. 2002. SUMO-1 targets RanGAP1 to kinetochores and mitotic spindles. J. Cell Biol. 156, 595-602.
  15. Barysch S.V. et al. 2014. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 9, 896-909.

アセチルリジン マウスモノクローナル抗体

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti Acetyl Lysine (Trial size),  (Mouse) , 3C6.08.20詳細データ CYT AAC01-S 25 UL
[1 x 25 μl]
¥30,000
Anti Acetyl Lysine,  (Mouse) , 3C6.08.20詳細データ CYT AAC01 200 UL
[2 x 100 μl]
¥105,000

ホスホチロシン(リン酸化チロシン) マウスモノクローナル抗体

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti Phosphotyrosine (Trial Size),  (Mouse) , 27B10.4詳細データ CYT APY03-S 1*25 UL
¥30,000
Anti Phosphotyrosine,  (Mouse) , 27B10.4詳細データ CYT APY03 2*100 UL
¥105,000

SUMO-2/3 マウスモノクローナル抗体(クローン 12F3)

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti SUMO 2/3 (Trial Size),  (Mouse) , 12F3詳細データ CYT ASM23-S 25 UL
[1 x 25 μl]
¥30,000
Anti SUMO-2/3,  (Mouse) , 12F3詳細データ CYT ASM23 200 UL
[2 x 100 μl]
¥105,000

SUMO-2/3 マウスモノクローナル抗体(クローン 11G2)

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti SUMO-2/3 (Trial Size),  (Mouse) , 11G2詳細データ CYT ASM24-S 1*150 UL
¥38,000
Anti SUMO-2/3,  (Mouse) , 11G2詳細データ CYT ASM24 2*200 UL
¥107,000

ユビキチン マウスモノクローナル抗体

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Anti Ubiquitin (Trial size),  (Mouse) , P4D2詳細データ CYT AUB01-S 1*25 UL
¥29,000
Anti Ubiquitin,  (Mouse) , P4D2詳細データ CYT AUB01 2*100 UL
¥105,000

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