有糸分裂制御タンパク質におけるSUMO化の重要性 CYTOSKELETON NEWS 2015年6月号

はじめに

有糸分裂が正常に行われるためには、無数のタンパク質の精巧な調節と相互作用が必要となります。近年、翻訳後修飾（PTM）の一つであるSUMO化が、有糸分裂の制御に関わるタンパク質の機能調節において重要な役割を担っていることが明らかになりました¹。SUMO（Small Ubiquitin-like MOdifier）タンパク質は、複数の酵素の働きにより、標的タンパク質のリジン残基に共有結合します^2,3。SUMO化された有糸分裂タンパク質は、核内に高密度に局在し、逆反応である脱SUMO化、または、ユビキチンを介したタンパク質分解のいずれかによって量的に調節されると考えられています^4,5。3種類のSUMOパラログ（SUMO 1, 2, 3）と SUMO-2/3 は高い相同性を有し、同一のグループに分類されます。SUMO-1 と SUMO-2/3 は、それぞれ標的となるタンパク質が異なり、機能や細胞内局在にも違いが見られます⁶。有糸分裂における動的なSUMOを介した経路の解析には、SUMOコンジュゲートの正確な識別が非常に重要になります。しかし、以前は高品質なSUMOタンパク質抗体が存在せず、低レベルのコンジュゲートの検出は非常に困難でした。本稿では、SUMO-2/3 による修飾が有糸分裂をどのように調節するかを簡潔に説明し、SUMO-2/3 により修飾されたタンパク質の検出に使用できる新しい抗体をご紹介します。

有糸分裂に関わるタンパク質のSUMO化による調節

SUMO化は、タンパク質の結合モチーフや安定性、輸送を変化させることにより、有糸分裂に関わるタンパク質の機能を動的に調節します。例えば、染色体パッセンジャー複合体（chromosomal passenger complex; CPC）を形成する有糸分裂期キナーゼである Aurora B⁷ と Borealin⁸ は、SUMO-2/3 によって修飾されます。Aurora B は、CPC の触媒サブユニットで、SUMO化を受けるとキナーゼ活性が亢進します⁷。 CPC は、染色体の紡錘体赤道面への整列、紡錘体-動原体結合、細胞質分裂などの有糸分裂イベントを調節します^7,8。もう一つの重要な SUMO-2/3 によってSUMO化される有糸分裂タンパク質は、DNAトポイソメラーゼ II です。SUMO化されたトポイソメラーゼは、染色体が適切に分離されるために重要な役割を果たしています⁹。また、SUMO-2/3 は、動原体に局在するタンパク質である BubR1 および Nuf2 のSUMO化に関与します。これらのタンパク質は、微小管（MT）キネシンモーター分子である CENP-E とポリ SUMO-2/3 との、非共有結合性相互作用に関与すると考えられています。この翻訳後修飾は、モーターが適切に局在化して機能する（MTと動原体との結合など）ために非常に重要です。

図1 間期（A： パネル左）および中期（B： パネル右）における HeLa 細胞の蛍光免疫染色。
細胞を、α/β-チューブリン抗体（ヒツジ抗チューブリン抗体、品番： ATN02、緑色）および SUMO-2/3 抗体（クローン 12F3、品番： ASM23、赤色）を用いて染色した。DNAはDAPIを用いて染色した。

有糸分裂における内在性 SUMO-2/3 の検出

SUMOコンジュゲートの発現は低レベルなため、クルードな細胞／組織ライセートからのSUMO化タンパク質の検出は非常に困難です。解析を行うには、ターゲットタンパク質の濃縮が必要となります¹¹。免疫沈降（IP）は、効率的に濃縮できる手法ですが、SUMOタンパク質に特異的に結合する親和性の高い抗体が必要となります。近年、タンデムな SUMO 相互作用モチーフ（SUMO interacting motifs; SIMs）を利用したプルダウンアッセイにより、特異的なターゲットの検出が可能であることが報告されましたが、この方法は一般的ではなく、夾雑物による影響を受ける可能性があります¹²。最も一般的なのは、エピトープタグを付加したSUMO変異体を発現する細胞株を用いる方法です¹³。しかし、細胞株の構築には時間と手間がかかり、変異SUMOタンパク質を過剰発現させると、細胞の恒常性を乱す可能性があります。現在では、SUMO-2/3 を認識する高品質な抗体を研究にご利用いただくことが可能です。Cytoskeleton社では、2種類の SUMO-2/3 抗体を開発しました。クローン 12F3（品番： ASM23）は、WB、IF、IP などのアプリケーションにおいて、一般的に使用されているクローン 8A2 よりも優れたパフォーマンスを示します。もう一方のクローン 11G2（品番： ASM24）は、非常に高感度な免疫沈降を可能とします。IF（図1）および IP（図2）実験は、以前に報告された結果と一致しています^10,11。大部分の SUMO-2/3 コンジュゲートは、間期に核に大量に局在しますが（図1A）、細胞質タンパク質もSUMO化を受けます（図1A の挿入画像を参照）。細胞が有糸分裂に入ると、数種類のSUMO化タンパク質（例： RanGAP1¹⁴ および トポイソメラーゼ II⁹）が、動原体微小管上にはっきりと可視化されます（図1B）。IP によりSUMO化タンパク質を濃縮することで、TFII-I などの特定のターゲットの検出が（低レベルであっても）可能になります。11G2 および 12F3 抗体を用いて、HeLa細胞ライセートから SUMO-2/3 コンジュゲートを沈殿させます。トータルの沈殿物を、抗 SUMO-2/3 抗体（12F3）でイムノブロットし、特定のタンパク質（TFII-I および RanGAP1）をそれぞれに対する抗体で検出しました（図2）。興味深いことに、RanGAP1 は SUMO-1¹¹ または SUMO-2/3 のいずれかによってモノSUMO化されます。2種類の抗体を用いて沈殿させた SUMO-2/3 コンジュゲートは、それぞれわずかに異なる特性を示します。12F3 は線状エピトープを認識することが確認されていますが、11G2 はエピトープの立体構造を認識すると考えられます。

図2 11G2 および 12F3 を用いた SUMO-2/3 の免疫沈降
HS43（43℃ ヒートショック）、CT37（コントロール）、KD S2（SUMO-2 shRNA ノックダウン）から、変性細胞ライセートを調製した¹⁵。矢印は抗体の重鎖および軽鎖を、丸印（○）は結合していないフリーのSUMOを示す。

まとめ

PTMにより有糸分裂に関わるタンパク質の機能が微調整されることで、細胞分裂が正常に行われます。PTMの動的な性質を完全に理解するには、基質タンパク質と下流のシグナル伝達カスケードを同定する必要があります。有糸分裂（およびその他の細胞プロセス）におけるPTMを介した調節機構は、その多くがまだ発見されていません。Cytoskeleton社では、SUMO-2/3 によるSUMO化を含む、様々なPTMに特異的な抗体を開発しました。これらの抗体は、新しいPTMターゲットの検出や研究、および、有糸分裂やその他の細胞プロセスにおける調節機構の解析にご利用いただけます。

■ CYTOSKELETON NEWS バックナンバー

• 2020年10月号　紡錘体 - 可視化に向けた新規ツール
• 2020年8月号　細胞膜染色用蛍光プローブ
• 2020年4月号　生細胞におけるF-アクチンプローブ
• 2020年3月号　コロナウイルスと細胞骨格
• 2020年2月号　タウ（Tau）の将来性をMapping
• 2020年1月号　Rho GTPaseによる細胞遊走制御

• 2019年12月号　表現型プロファイリング：アクチンに焦点を当てたがん治療
• 2019年11月号　チューブリンの過剰グルタミル化、ミトコンドリア、神経変性
• 2019年9月号　細胞運動性を制御するために相互作用する膜張力とアクチン細胞骨格
• 2019年8月号　Rac1B、がん、およびRac1
• 2019年7月号　Rhoファミリー GTPases、神経可塑性、およびうつ状態
• 2019年6月号　アクチンメチオニン酸化： 動的制御の次の段階
• 2019年5月号　ミクログリアと神経変性疾患
• 2019年2月号　生細胞画像化に対するCNS疾患や障害

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