GTPase 活性化アッセイ： アイソフォームの検出 CYTOSKELETON NEWS 2014年11月／12月号

Ras/Rho ファミリー GTPase は、発生、増殖、運動、細胞内輸送などの多様なアクチン依存的細胞プロセスの調節に重要な役割を果たしている低分子量Gタンパク質です^1,2。さらに、Ras/Rho ファミリー GTPase の機能不全は、ヒトの疾患（例： 癌、神経変性）に関連しており、これらの GTPase は多くの病原性細菌の標的となっています^3-5。GTPase ファミリーは多数のアイソフォームから構成されており、Rho ファミリーには Cdc42、RhoJ、RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac3 が、Ras ファミリーには N-Ras、K-Ras、H-Ras が含まれます。これらの GTPase は、生理学的および病理学的プロセスにおいて主要な役割を担っていることから、特定の Rho/Ras アイソフォーム活性を測定する技術は非常に有用であると考えられます（表1、2）。

Rho/Ras ファミリー GTPase は、不活性な GDP 結合型と、活性を有する GTP 結合型のサイクルをくり返しています。従来の低分子量 GTPase 活性化アッセイは、アガロースビーズに結合したエフェクタータンパク質を利用して活性化 GTPase を単離（プルダウン）した後、ウエスタンブロットで定量化します。G-LISA は、プルダウンアッセイの代替として使用できる、より定量的で迅速、高感度な ELISA 法に基づく活性化アッセイです。Cytoskeleton（サイトスケルトン／CYT）社では、プルダウンと G-LISA の両方のキットを提供しており、どちらのキットも特定の Ras/Rho ファミリーアイソフォーム活性を測定するために、アッセイ条件の変更が可能です（表1、2）。重要なのは、アイソフォーム（例： H-Ras と K-Ras/N-Ras、RhoC と RhoA）によっては、他の関連するアイソフォームよりかなり低いレベルで発現する場合があることです^6,7。発現量に大きな差があるため、低発現のアイソフォームの検出は困難です。ライセート濃度、溶解バッファー、抗体濃度／希釈率、といったアッセイ条件を変更し、至適条件を検討しますが、下記の例では、主にライセートの用量設定やアイソフォーム特異的な抗体について変更を行っています。

RhoA G-LISA キットを使用した RhoB/RhoC 活性の測定

Rho GTPase は、様々な生理学的および病理学的な細胞機能を仲介しています。Cytoskeleton 社の RhoA G-LISA キットは、血管新生（既存の血管系から新しい血管が形成される現象）における RhoB 活性の研究に使用されました。血管新生には成長因子による内皮細胞の活性化が必要となり、RhoB は成長因子の輸送および機能を調節することがわかっていることから^8,9、内皮細胞の成長因子を介した血管新生において RhoB の果たす役割が検討されました¹⁰。血管内皮細胞増殖因子（VEGF）で刺激した後、RhoB の発現および活性が測定されました。活性の測定には、キットに標準で付属する RhoA 抗体を RhoB 抗体に変更した RhoA G-LISA キットが使用されました。得られた結果から、VEGF が介する内皮細胞の形態形成は、RhoB による（および RhoB が介する）RhoA 活性の阻害に依存する、と報告されています¹⁰。

RhoA G-LISA キットは、RhoB 活性の他に、RhoC 活性の測定にも使用できます。RhoC の恒常的な活性は、多くの癌において腫瘍の進行、浸潤、転移に相関することから、RhoC は癌細胞の運動性に関与していると考えられています^11-13。RhoA 抗体を RhoC 抗体に変更した RhoA G-LISA 活性化アッセイキットを使用して、前立腺癌の骨転移における RhoC の役割が検討されました¹⁴。また、RhoC 活性の制御因子も検討され、コレステロール生合成阻害剤であるアトルバスタチンが、多くの頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）細胞株において RhoC 活性を低下させることが報告されました¹⁵。その後、同じ腫瘍細胞株における microRNA-138 の発現が検討され、microRNA-138 は RhoC 発現および活性を負に制御すると報告されました¹⁶。どちらの論文でも^15,16、RhoA 抗体を RhoC 抗体に変更した RhoA G-LISA キットを使用して、RhoC 活性の測定が行われています。

Ras プルダウンキットを使用した N-Ras 活性の測定

Ras は、Rho と同様に、癌や炎症性疾患などの多様な病態に関与する GTPase です。最近、Cytoskeleton 社の Ras プルダウンキットは、以前使われていた pan Ras 抗体が N-Ras 特異的抗体に変更され、N-Ras 活性を特異的に測定できるように改良されました¹⁷。このキットを使用して、原発性硬化性胆管炎（PSC）に伴う胆管細胞の老化に関与する分子経路が検討され、胆管細胞（胆管の上皮細胞）における N-Ras の発現および活性レベルの変化が焦点となりました¹⁷。

Cdc42 G-LISA キット／PAK ビーズを使用した RhoJ 活性の測定

RhoJ は、まだ研究報告が少ない GTPaseですが、 Cdc42 とアミノ酸配列が 55% の相同性を示すことがわかっており、Cytoskeleton 社の Cdc42 G-LISA キット¹⁸ または Cdc42 プルダウンキットに付属する PAK (p21-activated kinase 1 protein)-GST ビーズを用いて測定することが可能です¹⁹。様々な網膜症の原因となる異常な血管形成における GTPase の役割を解明することを目的として、HEK-293T および内皮細胞において、VEGF が介する Cdc42 および外因的に発現させた RhoJ の活性が測定されています。

プルダウンキット／G-LISA キットでアイソフォームを測定するには

特定の Ras/Rho アイソフォーム活性を測定するには、表1に示した文献リストをご参照ください。目的のアイソフォームに関する参考文献がない場合は、最も近い活性化アッセイキットを使用し、活性化したライセートおよび活性化していないライセートに対して特定の一次抗体を 1:50、1:100、1:200 で希釈してテストし、適切な濃度を設定してください。活性化／非活性化ライセートは、アッセイマニュアルに従い、血清含有培地中で 50% コンフルエントにした細胞を PBS で2回洗浄し、ライセートを調製して保存することで作製できます。分注したライセートを1つ解凍し、室温で1時間インキュベートして GTPase の活性レベルを低下させ、非活性化状態にします。未処理のライセートは、血清により最も増殖が促進され、活性化した状態であると考えられます。活性化／非活性化ライセートの調製には、ライセートをそれぞれ GTPγS または GDP とインキュベートする方法もあります（プルダウンアッセイマニュアルに記載）。

まとめ

アッセイ条件の変更が可能なのは、Rho および Ras 活性化アッセイだけではありません。Rac1活性化アッセイキットを使用した Rac2 / Rac3 活性の研究、RalA 活性化アッセイキットを用いた RalB の研究、Ras 活性化アッセイキットを用いた H-Ras / K-Ras / N-Ras の研究にも、同様の変更を適用できます（表2）。汎用性に優れたこれらのアッセイキットは、GTPase 活性化の研究に有用であると考えられます。

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• 2020年4月号　生細胞におけるF-アクチンプローブ
• 2020年3月号　コロナウイルスと細胞骨格
• 2020年2月号　タウ（Tau）の将来性をMapping
• 2020年1月号　Rho GTPaseによる細胞遊走制御

• 2019年12月号　表現型プロファイリング：アクチンに焦点を当てたがん治療
• 2019年11月号　チューブリンの過剰グルタミル化、ミトコンドリア、神経変性
• 2019年9月号　細胞運動性を制御するために相互作用する膜張力とアクチン細胞骨格
• 2019年8月号　Rac1B、がん、およびRac1
• 2019年7月号　Rhoファミリー GTPases、神経可塑性、およびうつ状態
• 2019年6月号　アクチンメチオニン酸化： 動的制御の次の段階
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