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表現型プロファイリング:アクチンに焦点を当てたがん治療 CYTOSKELETON NEWS 2019年12月号

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CYTOSKELETON NEWS 2019年12月号

表現型プロファイリング:アクチンに焦点を当てたがん治療

アクチンは哺乳動物の細胞骨格に必須の構成成分であり、細胞増殖、運動性、輸送、および、分裂といった多数の生理学的機能に関与しています。これらの基本的な機能には、アクチンを基盤とする神経突起(例えば、lamellipodia;葉状仮足、Filopodia;糸状仮足)の伸展や退縮と同様にアクチン細胞骨格のリモデリングが必要です。これらは線維状アクチン(F-アクチン)と単量体アクチン(G-アクチン)間の迅速な動的サイクルに依存しています1)。このことに相応して、アクチン細胞骨格ダイナミクスの機能障害は多くのヒト疾患の病態生理学的特徴であり、がんが典型的な例です。このような理由から、アクチンは理論的に考えて魅力的な抗がん治療標的です。しかしながら、実際にはアクチンはその有毒な副作用のため標的としてあまり適切でないことが示されています。その理由として、治療においてアクチンのアイソフォームを区別できないことが挙げられます2, 3)。このため、がん細胞および正常細胞内のアクチンは、アクチンに直接作用するがん治療の影響を受けて様々な臓器系(例えば、心臓や横隔膜)に毒性副作用を引き起こします2, 3)。近年、創薬はアクチンからArp2/3複合体やトロポミオシン(Tpms)のようなアクチン関連構造タンパク質へと移行しています。これらのタンパク質には選択標的を可能にする複数のアイソフォームがあり、毒性副作用を避けられる可能性があるためです2-4)(Fig. A)。

cytoskeleton_news_201912_01.png
Fig. A:トロポミオシンアイソフォーム3.1(Tpm3.1)は、がん関連アクチン結合タンパク質です。Tpm3.1のN末端断片の結晶構造。PDB ID: 60TN
Fig. B:Tpm3.1はF-アクチンが非筋肉ミオシンIIおよびADF/コフィリンとどのように相互作用するかを制御する。参考文献[12]より引用。

構造タンパク質を標的としたアクチンダイナミクスを制御する薬物の開発には多くの課題があります。合理的な薬物設計を始める前に、機能ドメインマッピングと潜在的な薬物結合ポケットを同定し標的タンパク質の構造知識を取得します3)。Arp2/3やTpmsのようなアクチン関連制御タンパク質ではこれらのデータがありません(Fig. A)。完全な構造データがない場合、研究者は標的タンパク質に対する既存の化合物ライブラリを用いて機能阻害する薬物をスクリーニングします3)。推定される治療標的の特性は、特に特定のアイソフォームのみが疾患に関連している場合、選択的ターゲティングの可能性を提供する複数のアイソフォームの存在です。さらに、構造的なアイソフォームはより多くの薬物結合ポケットを提供します。これは、別の薬物が潜在的に異なる作用機序を介して同じタンパク質を調節できることを意味します。既存の低分子化合物ライブラリを利用し、アクチン結合タンパク質候補の構造知識の欠如に対処するために採用されている1つの技術は、表現型プロファイリングです3)。このスクリーニングプロトコルは、細胞イメージングを利用し、細胞サイズ、形態を含む複数の複雑な細胞構造に化合物がどのように影響するかを測定します。アクチンの場合には、関連する生物学的作用を有する化合物を同定するため、計算および自動画像分析によってフィラメントの詳細な特徴(数、長さ、形状、細胞内分布、シグナル強度)を測定します。さらに、関連する化合物の作用機序が既知の場合、得られた情報はこの化合物をさらに評価し、類似の表現型を有する他の化合物の作用機序を予測するためにも使用されます3, 7)

Arp2/3複合体およびTpmsは、がん創薬プログラムにおける有望な治療標的です3, 8-12)。Arp2/3の活性は、異なる作用機序を介して異なる薬物によって阻害されます11)。Tpmアイソフォームは、アクチン調節薬に対するF-アクチンの感受性を特異的に制御します3, 12)。Tpmsは40以上のアイソフォームがあり、細胞/組織の発生段階において、個々に空間的・時間的局在パターンを示します12)。アクチン細胞骨格は、アクチンとTpmの共重合体とTpmなしのアクチンの重合体の両方から構成されていますが13)、最近の研究ではTpmsがヒト細胞のFアクチンの大部分を覆っていることが報告されています14)。Tpmsは、アイソフォーム依存的にアクチンフィラメントの機能的能力を決定します15-21)(Fig. A)。治療標的としてさらなる研究に適しているタンパク質の重要な特徴のひとつに、がん細胞での活性/発現の特異的な調節があります。Tpmsでは、アイソフォーム3.1は複数のがん細胞株において有意かつ選択的に上方制御されています。それゆえ、特異的に標的化が可能な疾患関連アイソフォームといえます2, 14, 22, 23)(Fig. A)。また、筋肉のTpmsがこのアイソフォームを発現しないため、Tpm3.1を標的とすることで毒性副作用を回避できる点が重要です22, 24, 25)。現在研究されているのは、Tpm3.1の結合ポケット内の異なる分子相互作用を介してTpm3.1を選択的に標的とする構造的に特異的な3つの低分子化合物です3, 22, 24, 25)

まとめ

新規抗がん治療標的としてアクチン関連構造タンパク質を研究することは、特異的な新しいがん治療法の開発に大きな可能性をもたらしますが、表現型スクリーニングを用いる場合にはいくつかの注意点と方法論的考察があります。例えば、

  • 候補細胞株は、高度に保存されたアクチン細胞骨格を有していなければならない。
  • アクチン細胞骨格染色は自動化操作に対応しなければならない。
  • 異なるアクチン表現型は、特定のスクリーニングセットアップを用いて検出可能でなければならず、複数のパラメータが測定可能でなければならない(例えば、フィラメント数と長さ、細胞の形態と大きさ、F-アクチンの細胞内分布とその異なる構造形態など)。
  • 心筋細胞と骨格筋細胞内のアクチンダイナミクスに影響を与えてはならない。3)
研究者の皆様が様々な化合物のアクチンや関連タンパク質との相互作用をスクリーニングする手助けを行えるよう、Cytoskeleton社では様々な精製アクチンタンパク質、アクチン関連タンパク質、アクチン活性や結合アッセイキット、およびF-アクチンの生細胞画像化プローブをご用意しています。

参考文献

  1. Pollard T.D. 2016. What we know and do not know about actin. In: Jockusch B. (eds.) The Actin Cytoskeleton. Handbook of Experimental Pharmacology. vol. 235. Springer, Cham.
  2. Bonello T.T. et al. 2009. New approaches to targeting the actin cytoskeleton for chemotherapy. Future Med. Chem. 1, 1311-1331.
  3. Bryce N.S. et al. 2019. Chemical biology approaches targeting the actin cytoskeleton through phenotypic screening. Curr. Opin. Chem. Biol. 51, 40-47.
  4. Creed S.J. et al. 2008. Tropomyosin isoforms define distinct microfilament populations with different drug susceptibility. Eur. J. Cell Biol. 87, 709-720.
  5. Feng Y. et al. 2009. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 567-578.
  6. Eliceiri K.W. et al. 2012. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710.
  7. Caicedo J.C. et al. 2017. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nat. Methods. 14, 849-863.
  8. Jay P. et al. 2000. ARP3beta, the gene encoding a new human actin-related protein, is alternatively spliced and predominantly expressed in brain neuronal cells. Eur. J. Biochem. 267, 2921-2928.
  9. Millard T.H. et al. 2003. Identification and characterisation of a novel human isoform of Arp2/3 complex subunit p16-ARC/ARPC5. Cell Motil. Cytoskeleton. 54, 81-90.
  10. Abella J.V. et al. 2016. Isoform diversity in the Arp2/3 complex determines actin filament dynamics. Nat. Cell Biol. 18, 76-86.
  11. Nolen B.J. et al. 2009. Characterization of two classes of small molecule inhibitors of Arp2/3 complex. Nature. 460, 1031-1034.
  12. Gunning P.W. et al. 2015. Tropomyosin - master regulator of actin filament function in the cytoskeleton. J. Cell Sci. 128, 2965-2974.
  13. Lazarides E. 1976. Two general classes of cytoplasmic actin filaments in tissue culture cells: the role of tropomyosin. J. Supramol. Struct. 5, 531-563.
  14. Meiring J.C.M. et al 2018. Co-polymers of actin and tropomyosin account for a major fraction of the human actin cytoskeleton. Curr. Biol. 28, 2331-2337.
  15. Bryce N.S. et al. 2003. Specification of actin filament function and molecular composition by tropomyosin isoforms. Mol. Biol. Cell 14, 1002-1016.
  16. Tojkander S. et al. 2011. A molecular pathway for myosin II recruitment to stress fibers. Curr. Biol.21, 539-550.
  17. Creed S.J. et al. 2011. Tropomyosin isoform 3 promotes the formation of filopodia by regulating the recruitment of actin-binding proteins to actin filaments. Exp. Cell Res. 317, 249-261.
  18. Janco M. et al. 2016. The impact of tropomyosins on actin filament assembly is isoform specific. Bioarchitecture 6, 61-75.
  19. Brayford S. et al. 2016. Tropomyosin promotes lamellipodial persistence by collaborating with Arp2/3 at the leading edge. Curr. Biol. 26, 1312-1318.
  20. Gateva G. et al. 2017. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Curr. Biol. 27, 705-713.
  21. Pathan-Chhatbar S. et al. 2018. Three mammalian tropomyosin isoforms have different regulatory effects on nonmuscle myosin-2B and filamentous b-actin in vitro. J. Biol. Chem. 293, 863-875.
  22. Stehn J.R. et al. 2013. A novel class of anticancer compounds targets the actin cytoskeleton in tumor cells. Cancer Res. 73, 5169-5182.
  23. Coombes J.D. et al 2015. Ras transformation overrides a proliferation defect induced by Tpm3.1 knockout. Cell. Mol. Biol. Lett. 20, 626-646.
  24. Currier M.A. et al. 2017. Identification of cancer-targeted tropomyosin inhibitors and their synergy with microtubule drugs. Mol. Cancer Ther. 16, 1555-1565.
  25. Kee A.J. et al. 2018. On-target action of anti-tropomyosin drugs regulates glucose metabolism. Sci. Rep. 8, 4604.

Actin Biochem Kits

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Actin Binding Protein Spin-down Biochem Kit (for muscle)詳細データ CYT BK001 1 KIT
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Unlabeled Actin Proteins

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Actin protein (rabbit skeletal muscle, >99% pure), Rabbit, Unlabeled詳細データ CYT AKL99-A 4*250 UG
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