記事ID ： 14898

Ral GTPase を調節する翻訳後修飾 CYTOSKELETON NEWS 2015年3月号

カテゴリから探す > 特集 > 取扱いメーカー

メーカー名：Cytoskeleton, Inc.

Ral GTPase を調節する翻訳後修飾

RalA および RalB GTPase は、細胞の運動性、形態、シグナル伝達、小胞輸送、エンドサイトーシス／エキソサイトーシスなどを調節しています。このような機能の調節は、癌の発生や転移に重要であることから^1-4、Ral は発癌および転移に関与すると考えられています。どちらのアイソフォームも、Ras が仲介する腫瘍形成、転移、浸潤に不可欠です^2-6。RalA と RalB は、 82%のアミノ酸配列が同一であり、かつ、エフェクターや構造的／生化学的特性を共有していますが⁴、細胞内局在やエフェクターとの相互作用が異なるため、発癌においてそれぞれ独自の機能を果たします^2,4,7,8。Ral の局在、結合パートナー、機能などは、翻訳後修飾（PTM: post-translational modification）によって調節されます^2,4,9-11。Ral の翻訳後修飾は、Switch 1およびC末端の超可変領域内で見つかっており、ゲラニルゲラニル化、カルボキシメチル化、パルミトイル化、リン酸化、ユビキチン化などが報告されています^3,4（表1、2）。

ゲラニルゲラニル化

ゲラニルゲラニル化（GG: Geranylgeranylation）は、Ral の適切な膜局在化および機能に必要です^12,13。ゲラニルゲラニル化された RalA と RalB は、どちらも細胞膜に局在しますが¹³、細胞膜以外での局在は異なることが報告されています¹¹。どちらのアイソフォームも、ゲラニルゲラニル化のシグナルモチーフであるCAAXモチーフ（C=システイン、A=脂肪族アミノ酸、X=末端のアミノ酸）を末端に持ちます⁴。ゲラニルゲラニル化が起こると、修飾された末端のシステイン残基がカルボキシメチル化され、 AAX残基が酵素により切断されます^4,14。CAAXモチーフではなく、システインが2つ並んだCCAXモチーフを発現する Ral タンパク質では、2番目のシステインが、カルボキシメチル化ではなくパルミトイル化されます^4,15。CAAXプロセシング酵素は新薬開発のターゲットであり、Ral タンパク質が2種類の方法で修飾されることは、治療においてジレンマとなっています^16,17。CCAXモチーフを有するタンパク質は、治療の影響を受けないからです。

システイン残基の変異やゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（GGTase I）の薬理学的な阻害により、ゲラニルゲラニル化を抑制すると、Ral の膜との結合および機能が阻害されます¹³。GGTase I 阻害剤は両方のアイソフォームをターゲットとしますが、阻害による効果が異なります¹³。GGTase I 阻害剤は、どちらか一方の Ral アイソフォームの細胞膜への局在化を阻害し、その結果、Ral GTPase は細胞質全体および核周辺領域に観察されます¹³。また、GGTase I 阻害剤は、in vitro において、様々な癌細胞株の増殖を有意に抑制し^18,19、RalA の遺伝子破壊と同様の効果が示されています¹⁸。また、in vivo においても、GGTase I 阻害剤による抗腫瘍効果が報告されています¹⁹。

表1 Ral アイソフォーム／翻訳後修飾（PTM）／酵素
Ral アイソフォーム	翻訳後修飾（PTM）	酵素	修飾される Ral のアミノ酸	参考文献
RalA	リン酸化／脱リン酸化	AKA / PP2A Aβ	Ser194	21
RalA	リン酸化／脱リン酸化	不明 / PP2A Aβ	Ser183	20
RalB	リン酸化／脱リン酸化	PKC / 不明	Ser198	24
RalB	リン酸化／脱リン酸化	PKC α / 不明	Ser192	9
RalB	リン酸化／脱ユビキチン化	不明 / USP33	Lys47	26

Ser：セリン、Lys：リジン

表2 Ral の Switch 1 および超可変領域
RalA	EDYEPTKADSY ARKMEDSKEKNGKKKRKSLAKRIRERCCIL
RalB	EDYEPTKADSY TKKMSENKDKNGKKSSKN-KKSFKERCCLL

太字は Switch 1、その他は超可変領域を示す。
赤：共通する配列、緑：リン酸化部位、紫：ユビキチン化部位

リン酸化

Ral アイソフォームは、in vitro において、それぞれ異なるキナーゼを介して異なるセリン残基がリン酸化されます。RalA は、C末端の S183 残基²⁰ および S194 残基²¹ がリン酸化されると、活性化されます^10,21。どちらの残基も PP2A Aβ によって特異的に脱リン酸化され、RalA 活性が低下します²⁰。PP2A Aβの発現が低下すると、S194 および S183 のリン酸化が増加して RalA が活性化し、RalA を介した細胞の形質転換が誘導されます²⁰。S183 をリン酸化するキナーゼはまだわかっていませんが²²、S194 は Aurora A キナーゼ（AAK）によってリン酸化されます²¹。AAK を介して S194 がリン酸化されると、RalA が活性化される他に、活性化 RalA とエフェクタータンパク質である RalBP1 が細胞内膜へ輸送され、RalA/RalBP1 を介した下流のシグナルの増加が起こります¹⁰。例えば、リン酸化された RalA と RalBP1 は、ミトコンドリアやミトコンドリア由来の小胞に再局在化して、有糸分裂の際のミトコンドリア分裂につながるシグナル伝達系を開始させます²³。RalA は、リン酸化されると、エクソシスト複合体である Sec5 や Exo84 ではなく、RalBP1 に優先的に結合します¹⁰。さらに、S194 のリン酸化は、in vivo および in vitro で、RalA の発癌における機能を調節します^10,21。また、RalA は、PKA によってリン酸化されます（リン酸化される残基は未解明）²²。AKA阻害剤は、in vitro において癌細胞の増殖を有意に抑制し^18,19、in vivo において腫瘍形成を抑制し¹⁹、癌細胞において RalA の活性化を阻害することが報告されています¹⁹。

RalB は PKC によって S198 が²⁴、PKCαによって S192 がリン酸化されます⁹。in vitro では、S198 のリン酸化により RalB が活性化され⁹、細胞膜から細胞内小胞を含む⁹ 核周辺領域への再局在化が起こり²⁴、発癌における機能（足場非依存性増殖、細胞運動、アクチン細胞骨格のダイナミクスなど）が調節されます²⁴。In vivo では、RalB の S198 のリン酸化は、腫瘍の増殖や転移に必要となります²⁴。さらに、S198 のリン酸化は、RalB のエフェクターとの相互作用を変化させます。リン酸化を模倣した RalB は、内膜で RalBP1 に優先的に結合しますが、リン酸化を起こらなくした RalB は、細胞膜で Sec5 に結合します。RalB のリン酸化状態により、小胞の細胞膜への輸送、結合、小胞のカーゴ（積み荷）タンパク質の放出が調節されます⁹。

ユビキチン化

ユビキチン化は、プロテアソームによって分解されるタンパク質の目印となる他に、タンパク質の活性や局在化、および結合パートナーを制御しています。Ral アイソフォームは両方とも、活性化状態に関係なく、分解を引き起こさない方法で主にモノユビキチン化されます²⁵。しかし、RalA は（RalB は異なります）、足場非依存的に非分解性のユビキチン化によって修飾されます。どちらの Ral アイソフォームも細胞膜や内膜に存在していますが、恒常的にユビキチン化された Ral コンストラクトは、 RalA の（RalB は異なります）細胞膜への濃縮を誘導し、細胞内で斑点状に局在します。RalA のユビキチン化は、細胞膜における脂質ラフトの濃縮を引き起こします。RalA は、微小領域である脂質ラフトにおいて脱ユビキチン化され、ラフトを介したエンドサイトーシスを引き起こします²⁵。その後、一連のサイクルとして、脂質ラフトを介したエンドサートーシスにより、RalA のユビキチン化が促進され、エンドサイトーシスを阻害すると、ユビキチン化が抑制されます。Ral のユビキチン化部位の候補として、数種類のリジン残基が挙げられています²⁵。RalB の Lys47 残基のユビキチン化は、エフェクターとの結合やその後の機能を決定します。RalB はユビキチン化されると、 Exo84 ではなく Sec5 に結合します。しかし、RalB は脱ユビキチン化されると、優先的に Exo84 に結合します²⁶。Sec5 と結合すると自然免疫応答のシグナル伝達を仲介し、Exo84 に結合するとオートファゴサイトーシス（自己貪食）を仲介します²⁶。

まとめ

Ral GTPase は、様々な翻訳後修飾により、活性や細胞内局在、エフェクターとの結合、そして最終的には機能が調節されています。Ral タンパク質は、Ras を介した発癌に関与することから、Ral 活性をターゲットとした治療薬の開発が進められています²⁷。Ral と下流のエフェクターとの結合を直接ターゲットにする他に²⁷、翻訳後修飾の促進／抑制による Ral 活性の調節が試みられています。Cytoskeleton（サイトスケルトン）社では、この新規治療法の研究にご使用いただける Ral 活性アッセイや、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化などのPTMを特異的に認識するモノクローナル抗体をご提供しております。

アセチルリジンマウスモノクローナル抗体

アセチルリジンマウスモノクローナル抗体
- 翻訳後修飾されたアセチル化リジンを幅広く検出

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Anti Acetyl Lysine (Trial size), (Mouse) , 3C6.08.20	CYT	AAC01-S	25 UL [1 x 25 μl]	￥32,000
Anti Acetyl Lysine, (Mouse) , 3C6.08.20	CYT	AAC01	200 UL [2 x 100 μl]	￥114,000

ホスホチロシン（リン酸化チロシン）マウスモノクローナル抗体

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Anti Phosphotyrosine (Trial Size), (Mouse) , 27B10.4	CYT	APY03-S	1*25 UL	￥32,000
Anti Phosphotyrosine, (Mouse) , 27B10.4	CYT	APY03	2*100 UL	￥114,000

ユビキチン　マウスモノクローナル抗体

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Anti Ubiquitin (Trial size), (Mouse) , P4D2	CYT	AUB01-S	1*25 UL	￥32,000
Anti Ubiquitin, (Mouse) , P4D2	CYT	AUB01	2*100 UL	￥114,000

G-LISA® 活性型低分子量Gタンパク質定量キット

G-LISA® 活性型低分子量Gタンパク質定量キット
- 少量のサンプルから、3時間以内で活性型低分子量Gタンパク質を測定するキット

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
RalA G-LISA^(R) Activation Assay Kit	CYT	BK129	1 KIT [96 assays]	￥280,000

活性型低分子量Gタンパク質プルダウンアッセイ　Biochem Kit™

活性型低分子量Gタンパク質プルダウンアッセイ　Biochem Kit™
- 低分子量Gタンパク質活性化を、プルダウンアッセイで簡単に検出！

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
RalA Activation Assay Biochem Kit	CYT	BK040	50 ASSAY	納期未定お問い合わせ

参考文献

Camonis J.H. & White M.A. 2005. Ral GTPases: corrupting the exocyst in cancer cells. Trends Cell Biol. 15, 327-332.
N.F. Neel et al. 2011. The RalGEF-Ral effector signaling network: The road less traveled for Anti-Ras drug discovery. Genes Cancer. 2, 275-287.
D.F. Kashatus. 2013. Ral GTPases in tumorigenesis: Emerging from the shadows. Exp. Cell Res. 319, 2337-2342.
L.R. Gentry et al. 2014. Ral small GTPase signaling and oncogenesis: More than just 15 minutes of fame. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2976-2988.
Bodemann B.O. & White M.A. 2008. Ral GTPases and cancer: linchpin support of the tumorigenic platform. Nat. Rev. Cancer. 8, 133-140.
K.-H. Lim et al. 2005. Activation of RalA is critical for Ras-induced tumorigenesis of human cells. Cancer Cell. 7, 533–545.
Y. Chien & M.A. White. 2003. RAL GTPases are linchpin modulators of human tumour-cell proliferation and survival. EMBO Rep. 4, 800-806.
K.-H. Lim et al. 2006. Divergent roles for RalA and RalB in malignant growth of human pancreatic carcinoma cells. Curr. Biol. 16, 2385-2394.
T.M. Martin et al. 2012. Phosphorylation by protein kinase Ca regulates RalB small GTPase protein activation, subcellular localization, and effector utilization. J. Biol. Chem. 287, 14827-14836.
K.-H. Lim et al. 2010. Aurora-A phosphorylates, activates, and relocalizes the small GTPase RalA. Mol. Cell. Biol. 30, 508-523.
M. Shipitsin & L.A. Feig. 2004. RalA but not RalB enhances polarized delivery of membrane proteins to the basolateral surface of epithelial cells. Mol. Cell. Biol. 24, 5746-5756.
B.T. Kinsella et al. 1991. Carboxyl-terminal isoprenylation of Ras-related GTP-binding proteins encoded by racl, rac2, and ralA. J. Biol. Chem. 266, 9786-9794.
S.C. Falsetti et al. 2007. Geranylgeranyltransferase I inhibitors target RalB to inhibit anchorage-dependent growth and induce apoptosis and RalA to inhibit anchorage-independent growth. Mol. Cell. Biol. 27, 8003-8014.
K.F. Leung et al. 2007. Rab GTPases containing a CAAX motif are processed post-geranylgeranylation by proteolysis and methylation. J. Biol. Chem. 282, 1487-1497.
A. Nishimura & M.E. Linder. 2013. Identification of a novel prenyl and palmitoyl modification at the CaaX motif of Cdc42 that regulates RhoGDI binding. Mol. Cell. Biol. 33, 1417-1429.
A.M. Winter-Vann & P.J. Casey. 2005. Post-prenylation-processing enzymes as new targets in oncogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5, 405-412.
S.A. Holstein & R.J. Hohl. 2012. Is there a future for prenyltransferase inhibitors in cancer therapy? Curr. Opin. Pharmacol. 12, 704-709.
M. Ezzeldin et al. 2014. RalA signaling pathway as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma (HCC). Mol. Oncol. 8, 1043-1053.
K. Wang et al. 2013. The role of RalA in biology and therapy of ovarian cancer. Oncotarget. PMID: 24632623.
A.A. Sablina et al. 2007. The tumor suppressor PP2A Ab regulates the RalA GTPase. Cell. 129, 969-982.
J.-C. Wu et al. 2005. Identification of V23RalA-Ser194 as a critical mediator for Aurora-A-induced cellular motility and transformation by small pool expression screening. J. Biol. Chem. 280, 9013-9022.
A.A. Sablina & W.C. Hahn. 2007. The role of PP2A A subunits in tumor suppression. Cell Adh. Migr. 1, 140-141.
D.F. Kashatus et al. 2011. RalA and RalBP1 regulate mitochondrial fission at mitosis. Nat. Cell Biol. 13, 1108-1115.
H. Wang et al. 2010. Phosphorylation of RalB is important for bladder cancer cell growth and metastasis. Cancer Res. 70, 8760-8769.
V. Neyraud et al. 2012. RalA and RalB proteins are ubiquitinated GTPases, and ubiquitinated RalA increases lipid raft exposure at the plasma membrane. J. Biol. Chem. 287, 29397-29405.
M. Simicek et al. 2013. The deubiquitylase USP33 discriminates between RalB functions in autophagy and innate immune response. Nat. Cell Biol. 15, 1220-1230.
C. Yan et al. 2014. Discovery and characterization of small molecules that target the GTPase Ral. Nature. 515, 443–447.