GEF を介した GTPase シグナル伝達の低分子阻害剤
Ras および Rho ファミリー GTPase は、発生、成長、運動性、細胞内輸送、遺伝子発現、細胞周期などの複数の細胞プロセスを調節します1,2。また、これらの GTPase の機能不全は、数種類のヒト疾患(例: 癌、神経変性、細菌性病因)に相関します3-5。Ras および Rho GTPase は、他の GTPase と同様に、活性型(GTP結合型)と不活性型(GDP結合型)との間を往復します。グアニンヌクレオチド交換因子(GEF: Guanine nucleotide exchange factor)は、様々な生理的および病理的な細胞外シグナルに応答して、GDPからGTPへの交換を促進することにより、GTPase 活性を調節します1,2。GEFは、このような性質から治療標的とされていますが、低分子阻害剤が結合するためには、GEF(または GTPase)上には通常見られない疎水性ポケットが必要になります。最近になってようやく、GEF および GTPase 上に新しい結合ポケットが発見されました6,7。本稿では、この観点から、Ras(N-、H-、K-Ras)および Rho(RhoA、Rac1、Cdc42)GEFに直接結合して阻害する、低分子阻害剤について考察します。
Rho GEF
Trio は、RhoA、RhoG、Rac を活性化する、マルチドメインを持つ Rho GEF です。Trio のC末端ドメイン(TrioC)は RhoA を活性化し、N末端ドメイン(TrioN)は RhoG および Rac を活性化します8。ペプチドアプタマーのスクリーニングにより、初の Rho GEF 阻害剤である TRIPa(Trio inhibitory peptide a)が見出されています。この阻害剤は、TrioC の Rho GEF ドメイン(TrioGEFD2)に結合し8、TRIPα および TrioGEFD2 を共発現する COS 細胞において、TrioGEFD2 の触媒活性 および Rho の活性化を阻害します8 (表1)。また、ペプチドアプタマーのスクリーニングにより、発癌性の Rho GEF である Tgat(Trio-related transforming gene in ATL tumor cells)に対する初の阻害剤 TRIPE32G も見出されています9。TRIPE32G は、Swiss 3T3 線維芽細胞において、Tgat のGEF活性と形質転換活性を阻害します(表1)。ヌードマウスに、Tgat と TRIPE32G を共発現する線維芽細胞を皮下注射すると、腫瘍を縮小させ、腫瘍の成長や重量の増加を遅らせます9。Rho GEF である LARG(leukemia-associated Rho GEF)は、Gタンパク質を調節する RGS(regulators of G-protein signaling)ドメインを含む GEF で、Y16 化合物によって阻害されます10。Y16 は、LARGの DH-PH junction に結合することにより、LARG と RhoA の相互作用を抑制します(表1)。また、Y16 は、RhoAと、RGSドメインを含むGEFである p115 RhoGEF および PDZ RhoGEF との相互作用を阻害します。さらに Y16 は、MCF-7 乳癌細胞において増殖や移動、浸潤を阻害します10。
Ras GEF
Ras 変異の活性化は、約 30% のヒト癌に関連しています。Ras の恒常的活性型変異が、GEFを介した活性化を必要とする理由はまだ解明されていませんが、Ras GEF 阻害剤の研究は現在も関心を集めています7。Ras GEF の中で最も多く研究されている SOS1 は、どちらも Ras の活性化に必要となる、Ras 交換モチーフドメイン(Ras exchanger motif domain)および CDC25 ホモロジードメイン(cell division cycle 25 homology domain)からなる触媒ドメインを有する、マルチドメインタンパク質です。これらのドメインには、Ras に結合するための触媒部位およびアロステリック部位が含まれます。触媒部位は GDP-Ras に結合し、GDP から GTP への交換を促進します7,11,12。触媒部位を直接標的とする低分子阻害剤のバーチャルスクリーニングが近年行われ、有望な候補化合物が数種類示されています13。
SOS1の低分子阻害剤である NSC-658497 は、濃度依存的に、触媒部位に特異的かつ直接結合し(表1)、Ras と SOS1 との結合を競合的に阻害し、SOS1を介した Ras の活性化を抑制します13。さらに、NSC-658497 は、マウス線維芽細胞 3T3、ならびに、野生型の K-Ras ではなく発癌性の K-Ras 変異を特異的に発現する前立腺・肺・卵巣癌細胞において、EGF刺激による Ras の活性化、および下流のシグナル伝達と増殖を阻害します13。同じ研究グループにより14、SOS1を特異的に阻害する化合物がさらに2つ同定され、UC-773587 および UC-857993 と名付けられました。この2つの化合物について、さらに生化学的・構造的に解析し、薬理学的な研究を行ったところ、どちらの化合物も、マウス線維芽細胞 3T3 や様々なヒト癌細胞株において、EGF刺激による Ras の活性化を阻害することが示されました。しかし、各化合物は、濃度依存的に、SOS1のドメイン内のそれぞれ異なる部位に μM 単位の親和性で結合していました(表1)。また、どちらの化合物も、細胞株において Ras の活性化および下流のシグナル伝達を阻害しました14。
GEF | 薬剤 | 結合親和性(Kd) | 参考文献 # |
---|---|---|---|
TrioC | Tripα | NR*;TrioC を介する RhoA のグアニンヌクレオチド交換活性における IC50 は 4 µM | 8 |
Tgat | TripE32G | NR*; Tgat を介する RhoA のグアニンヌクレオチド交換活性における見かけの阻害定数(Kiapp)は 2.4-12.4 µM | 9 |
LARG | Y16 | 80 nM | 10 |
SOS1 | NSC-658497 | 7 µM | 13 |
SOS1 | UC-773587 | 3.4 µM | 14 |
SOS1 | UC-857993 | 14.7 µM | 14 |
TrioN | ITX3 | NR*; TrioN を介する RhoG のグアニンヌクレオチド交換交換活性における IC50 は 76 µM | 15 |
*NR, 報告なし
Rac GEF
Rac は、他の Rho ファミリー GTPase と同様に、Trio や Vav1 などの複数の GEF によって活性化されます。TrioN に直接結合する阻害剤である低分子 ITX3 は、スクリーニングにより同定され、TrioN が誘導する RhoG と Rac1 のヌクレオチド交換を阻害し、TrioN が介する細胞形態の変化(例: NGFにより誘導される神経突起伸長)に拮抗します。ITX3 は、TrioN を介した Rac1 の活性化を阻害します(図1)15。Rac(および Cdc42)に対する GEF である Vav1 は、メラノーマおよび膵臓癌に関与しています16。プリン類似体であるアザチオプリン(azathioprine)は、抗炎症分子として知られていますが、現在は免疫細胞における Vav1 阻害剤としても認識されています。この報告の著者らは、膵臓癌細胞においても同様の研究を行い、アザチオプリンが、in vitro と in vivo の両方で、Vav1 を介する癌細胞の浸潤や移動、および細胞外マトリックスの分解を阻害することを見出しました16。
まとめ
GTPase の活性化は、様々な方法により阻害されます。そのうちの一つとして、GEFに低分子が直接結合し、GEFの GTPase への結合と、続いて起こる活性化(GDPからGTPへの変換)を阻害することが挙げられます。GEF(および GTPase)上の新規結合ポケットが発見されたことは、GTPase の阻害を目的とする創薬への大きな刺激となりました。Cytoskeleton社では、これらの研究にご利用いただける、様々な GTPase 活性化剤や阻害剤、精製 GTPase および GEF、細胞や組織ライセートで Ras / Rho GTPase の活性化を刺激し測定できる活性測定キットをご提供しております。
- Jaffe A.B. and Hall A. 2005. Rho GTPases: biochemistry and biology. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269.
- Heasman S.J. and Ridley A.J. 2008. Mammalian Rho GTPases: new insighs into their functions from in vivo studies. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 690-701.
- Kasri Nadif N. and Van Aelst L.. 2008. Rho-linked genes and neurological disorders. Pflugers Arch. 455, 787-797.
- Vega F.M. and Ridley A.J. 2008. Rho GTPases in cancer cell biology. FEBS Lett. 582, 2093-2101.
- Aktories K. 2011. Bacterial protein toxins that modify host regulatory GTPases. Nat. Rev. Microbiol. 9, 487-498.
- Quah S.Y. et al. 2016. Pharmacological modulation of oncogenic Ras by natural products and their derivatives: Renewed hope in the discovery of novel anti-Ras drugs. Pharmacol. Ther. 162, 35-57.
- Shima F. et al. 2015. Current status of the development of Ras inhibitors. J. Biochem. 158, 91-99.
- Schmidt S. et al. 2002. Identification of the first Rho-GEF inhibitor, TRIPa, which targets the RhoA-specific GEF domain of Trio. FEBS Lett. 523, 35-42.
- Bouquier N. et al. 2009. Aptamer-derived peptides as potent inhibitors of the oncogenic RhoGEF Tgat. Chem. Biol. 16, 391-400.
- Shang X. et al. 2013. Small-molecule inhibitors targeting G-protein-coupled Rho guanine nucleotide exchange factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3155-3160.
- Margarit S.M. et al. 2003. Structural evidence for feedback activation by Ras·GTP of the Ras-specific nucleotide exchange factor SOS. Cell. 112, 685-695.
- Sondermann H. et al. 2004. Structural analysis of autoinhibition in the Ras activator son of sevenless. Cell. 119, 393–405.
- Evelyn C.R. et al. 2014. Rational design of small molecule inhibitors targeting the Ras GEF, SOS1. Chem. Biol. 21, 1618-1628.
- Evelyn C.R. et al. 2015. Combined rational design and a high throughput screening platform for identifying chemical inhibitors of a Ras-activating enzyme. J. Biol. Chem. 290, 12879-12898.
- Bouquier N. et al. 2009. A cell active chemical GEF inhibitor selectively targets the Trio/RhoG/Rac1 signaling pathway. Chem. Biol. 16, 657-666.
- Razidlo G.L. et al. 2015. Targeting pancreatic cancer metastasis by inhibition of Vav1, a driver of tumor cell invasion. Cancer Res. 75, 2907-2915.
GEFタンパク質
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■ CYTOSKELETON NEWS バックナンバー
- 2020年10月号 紡錘体 - 可視化に向けた新規ツール
- 2020年8月号 細胞膜染色用蛍光プローブ
- 2020年4月号 生細胞におけるF-アクチンプローブ
- 2020年3月号 コロナウイルスと細胞骨格
- 2020年2月号 タウ(Tau)の将来性をMapping
- 2020年1月号 Rho GTPaseによる細胞遊走制御
- 2019年12月号 表現型プロファイリング:アクチンに焦点を当てたがん治療
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- 2019年9月号 細胞運動性を制御するために相互作用する膜張力とアクチン細胞骨格
- 2019年8月号 Rac1B、がん、およびRac1
- 2019年7月号 Rhoファミリー GTPases、神経可塑性、およびうつ状態
- 2019年6月号 アクチンメチオニン酸化: 動的制御の次の段階
- 2019年5月号 ミクログリアと神経変性疾患
- 2019年2月号 生細胞画像化に対するCNS疾患や障害
2018年
- 2018年12月号 アクチン細胞骨格とメカノトランスダクション(機械的シグナル伝達)
- 2018年11月号 軸索再生と細胞骨格
- 2018年10月号 ニューロンにおける微小管と極性
- 2018年8月号 Rab GTPase と 神経変性
- 2018年7月号 SUMO レスリング: バランスが全て
- 2018年6月号 なぜ K-Ras は発がん特異性を示すのか?
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- 2018年4月号 RhoファミリーGEFと樹状突起スパインの構造的可塑性
- 2018年3月号 βカテニンとTFC/LEF-1の翻訳後修飾による標準的なWntシグナル制御
- 2018年2月号 がん抑制遺伝子p53の翻訳後修飾による機能の調整
- 2018年1月号 自閉スペクトラム症におけるGEF Trioの役割
2017年
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- 2017年11月号 ミトコンドリアにおけるアセチル化:新たな考え方と治療への応用の可能性
- 2017年9月号 翻訳後修飾のアセチル化による微小管の安定化
- 2017年8月号 神経軸索におけるアクチンリングを基盤とした周期的膜骨格(PMS)
- 2017年7月号 E3ユビキチンリガーゼMdm2によるがん抑制遺伝子p53の翻訳後制御
- 2017年6月号 多能性幹細胞(PSC)での転写因子による翻訳後制御
- 2017年5月号 Arf6 GEF と癌細胞の浸潤・転移
- 2017年4月号 PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog)による翻訳後制御
- 2017年3月号 Tau の翻訳後修飾: アルツハイマー病の治療標的
- 2017年2月号 樹状細胞の移動におけるアクチン結合タンパク質とF-アクチン
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- 2016年11月/12月号 GEF を介した GTPase シグナル伝達の低分子阻害剤
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- 2016年5月号 チロシンリン酸化は Rhoファミリー GTPase 活性を調節する
- 2016年4月号 Rac1と糖尿病: ポジティブな役割とネガティブな役割
- 2016年3月号 SUMO化: 細胞骨格タンパク質の機能を調節するレギュレーター
- 2016年1月/2月号 ビメンチン中間径フィラメント: リン酸化による調節
2015年
- 2015年8月号 タンパク質調節に不可欠な翻訳後修飾
- 2015年7月号 アクチン細胞骨格のライブセルイメージング
- 2015年6月号 有糸分裂に関わるタンパク質のSUMO化: 局在と機能
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- 2015年3月号 増刊号 統合失調症において遺伝子変異により誘導されるアクチン依存のシナプスの変化
- 2015年3月号 Ral GTPase を調節する翻訳後修飾
- 2015年1月/2月号 RhoA のリン酸化はシグナル伝達を調節する
- 2015年1月号 増刊号 微小管を不安定化する suprafenacine: 新規抗癌剤のリード化合物としての可能性
2014年
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- 2014年11月号 増刊号 樹状突起の形態形成: ドーパミンD1受容体 および Rho ファミリー GTPase による制御
- 2014年11月/12月号 GTPase 活性化アッセイ: アイソフォームの検出
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- 2014年9月号 キネシンサブドメインの探索
- 2014年9月号 増刊号 アクチン結合タンパク質コフィリンの S-ニトロシル化: 細胞移動に対する影響
- 2014年8月号 増刊号 原発性硬化性胆管炎における N-Ras 発現および活性
- 2014年8月号 SUMO化: 細胞骨格タンパク質を標的とした翻訳後修飾
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- 2014年6月号 増刊号 頭頸部扁平上皮癌における microRNA-138 による RhoC のダウンレギュレーション
- 2014年6月号 Rho GTPase と活性酸素種: クロストークとフィードバック
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- 2014年4月号 リジンのアセチル化 - 多様な細胞プロセスの制御因子
- 2014年3月号 インテグリンを介したβ-アクチンの酸化還元制御: PDIの出現
- 2014年1/2月号 ダイニン: 一つのモーターが関わる複数の神経変性疾患
2013年
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- 2013年10月号 神経変性:Rhes、SUMO化、ハンチントン病
- 2013年9月号 モノユビキチン化:タンパク質調節のダイナミックなタグ
- 2013年8月号 Ras及びRhoのプレニル化による翻訳後修飾:癌創薬における役割
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- 2013年6月号 アクチン修飾と細胞骨格
- 2013年5月号 微小管内部の実体
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2012年
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- 2012年7月号 チューブリンの多重修飾:グルタミル化とグリシル化
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- 2012年3月号 G-LISAを用いた心臓研究: 糖尿病性心筋症におけるRho経路に関する研究
- 2012年1月/2月号 FtsZ: 新たな抗生剤の標的となるチュ−ブリンホモログ
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