細胞膜染色用蛍光プローブ CYTOSKELETON NEWS 2020年8月号

本ニュースレターでは、一般的に使用されている細胞膜染色用蛍光プローブの特徴について述べ、最新のプローブの飛躍的進歩の概要を紹介します。

細胞膜染色用蛍光プローブは、細胞膜に近接、または細胞膜内で結合することによって、細胞の周辺を可視化します。大きく分けて、小麦胚芽凝集素（Wheat germ agglutinin, WGA）複合体、脂質複合体、脂溶性色素、共有結合プローブ、生物物理学的レポータープローブの5種類の細胞膜染色用蛍光プローブがあります。
神経発生の解明を目的とした1980年代の研究では、神経細胞の形態が最も重要であったため、固定細胞において西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合WGA1が用いられました。しかし、HRPを可視化するのに必要な反応は、生細胞に対して細胞毒性を示しました^1）。そこで1986年に、Honigらは、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（DiIC18）と3,3'-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（DiOC18）の両方を用いることで、カチオン性カルボシアニン色素のパラダイムシフトの有用性を実証し、細胞培養において生きた神経細胞の一部の可視化に成功しました。1989年、当時Zynaxis Cell Science所属のPaul Karl Horanは、細胞染色の一貫性と生存性を高めるための浸透圧調節剤とプロトコルを作成し、シアニン色素の有用性を示す新規キットを開発しました。2000年代初頭に、毒性の低い蛍光結合WGAがWGA-HRPの代替品として使用されるようになりましたが、長期の神経発生研究に必要な安定性と効率は依然として欠けていました^1）3）。
近年、MemGlow™ (MemBright™ family⁴⁾)、Flipper-TR^5a）、Nile Red-basedプローブ^5b）6）などの新しい蛍光プローブが開発されました。これらのプローブは、膜の構造と機能を今までにない解像度で可視化することが可能で、加えてFlipper-TR、Nile Red-basedプローブは、生物物理学的センサーとして作用することができます。

図1 MemGlow™488で標識されたライブHEK293の広視野蛍光イメージング
矢印は、細胞を接続する糸状仮足およびナノチューブチャネルを示す。
画像はM. Collot氏（CNRS, France.）の御厚意により提供。

WGAは、細胞表面に存在するグリカンである、N-アセチルグルコサミンとN-アセチルノイラミン酸と優先的に結合するレクチンです^7）。これらのグリカンは、一般的にタンパク質に結合しており、その局在によって細胞膜が間接的に可視化されます。現在のWGAマーカーは、Alexa Fluor-conjugationを利用しており、糖鎖の細胞表面マーカーの局在を可視化し、細胞膜を間接的に検出できるようになっています。蛍光色素分子結合型WGAプローブの重要な欠点は、細胞表面の糖鎖が細胞膜の組成によって変化するため、特定の細胞種において細胞間で染色の違いが生じてしまうことです^4）8）。さらに、標識WGAは、サイズが大きいため、移動が制限されてしまい、3D細胞培養および組織を効率的に染色することができません。

PKH色素は、蛍光色素分子を細胞膜の脂質領域に挿入して固定する炭素鎖を有しています。PKH色素は、生細胞中の細胞膜の特徴付けを可能にしますが、5〜100日の半減期が報告されており、不均一染色を減少させるために長時間のプロトコルおよび独自の等浸透圧試薬を必要とします。シアニンPKH色素は、膜発現因子を必要とせずに細胞膜の特異的標識を可能にします。現在利用可能なPKH色素は、PKH2、PKH26、およびPKH67であり、504 nmから567 nmという限定された範囲の発光スペクトルを有します。PKH色素は、プロトコルにおいて、色素インターカレーションの後に、血清またはBSAタンパク質の添加による色素消光ステップを必要とします^9）10）。結合していない色素を消光しなければ、色素が凝集し、共培養に影響を及ぼしたり、細胞を凝集させたりする場合があります。関連して、近年のデータでは、PKH26による標識がエクソソームの膨張を引き起こし、これがエクソソームの生体内分布と細胞取り込みを変化させる可能性があり、研究の結果を混乱させる可能性が示唆されています^11）。一般的にPKH標識は、水溶性が乏しいため、有効な膜染色には比較的高濃度を必要とし、非効率的です^12）。

長鎖脂溶性カルボシアニン色素である、DiI、DiD、DiA、DiR、およびDiOは、広範囲の励起発光スペクトルを持つ、良く知られた細胞膜染色色素およびニューロンの逆行性トレーサーです。3,3'-ジオクタデシルシアニン過塩素酸塩（DiO; DiOC18(3)）は501 nm、Dil は565 nm、4-(4-(ジデシルアミノ)スチリル)-N-メチルピリジニウムヨウ化物（4-Di-10-ASP）は、590 nm、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩（DiDオイル; DiIC18(5)オイル）は665 nm、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（DiR; DiIC18(7)）は780 nmにおいてピークの蛍光を発します。これらのカルボシアニン色素は、可視スペクトル範囲を広くカバーしていますが、水にはほとんど溶けません。そのため、水溶液中で強く凝集し、細胞膜の染色を十分に行うことができません^12）。 例えばDiAが染色できる条件では、DiIは膜を効率的に標識することができますが、DiOは組織を染色することができず、far-red DiDは、点状の染色を生じてしまいます^13）。カルボシアニン色素は、細胞透過性を高めるために使用されるTriton-X 100が必要な、共標識用途においても適合しません^4）14）。

Advanced Membrane Probesは、これまでに得られなかった高解像度機能を有しています。

MemGlow™プローブは、リン脂質膜を染色するための新規蛍光プローブです。蛍光性シアニンを基にし、近赤外光を含む広いスペクトル範囲（Abs.max 499〜688nm, Em.max 506〜713）⁴⁾で、蛍光波長の異なる5種類のプローブを用意しています。MemGlow™製品は、カルボシアニンペアレント色素の特性を多く有しており、更に細胞応用における一般的な標識製品に比べ、より効果的であることが示されています。MemGlow™色素の利点は、2つの双性イオンアンカーの化学的接着によって強化された、対称シアニンによる化学構造に起因します。両親媒性アンカーは、ミセル凝集体の形で水溶性を改善し、プローブ凝集体の細胞膜への解離とインターカレーションを促進すると同時に、その保持を高めます（図2）。赤色にシフトしたMemGlow™プローブ（MemGlow™590およびMemGlow™700）は、脂溶性の増大およびエンドサイトーシスに対する抵抗性を付与する、付加的な融合ベンゼン環を有しています。

図2 MemGlow™プローブのメカニズム
MemGlow™プローブは、細胞膜とのインターカレーションによって励起が可能になるまで、自己消光されたナノ粒子である。

MemGlow™のアプリケーションはシンプルです。 MemGlow™プローブが水性溶媒に導入されると、細胞膜との接触によって誘発される脂質二重層への解離と分散が生じるまで、両親媒性プローブは自己消光凝集体を形成します。 蛍光発生プローブが組み込まれることにより、バイオイメージングが可能となります。 MemGlow™ 488からMemGlow™ 700までのMemGlow™プローブは、バックグラウンドの何倍も強い蛍光を発し、良好なシグナル対バックグラウンド比を示します^4）。 MemGlow™色素は、技術的な進歩により、従来の染色法よりも多くの利点があります（表1)。
1）PKH色素は、複雑なプロトコルを必要とし、生物学的な変化が生じます。
2) 長鎖カルボシアニン色素は、強く凝集するため、可変的で不均一な色素依存特性を有し、Triton X-100による透過処理に不適合です。
3）WGA Alexa標識液は、一貫性のある結果を得るために、細胞表面のグリカンが均一に発現する必要があります。 MemGlow™標識は極めて効率的で、ナノモル濃度でも細胞間の糸状仮足とナノチューブの可視化が可能です（図3）。

図3
生きたKB細胞をMemGlow 488™で染色し、レーザー走査型共焦点顕微鏡でイメージングした3D再現。MemGlow™488、50 nMで5分間染色し、洗浄せずにイメージングした。細胞間糸状仮足とナノチューブが細胞間で見える（白い矢印）。画像はオレンジの偽色で染色。画像はM. Collot氏（CNRS, France）の御厚意により提供。

膜張力の測定は、実施が困難であり、専門的な訓練が必要です。しかし、現代の蛍光プローブは膜張力測定の利便性が改良されています。Fluorescent LIPid Tension Reporter（Flipper TR™）は生細胞に対する蛍光発生的な膜張力プローブであり、専門的な知識を有する生物物理学者によって開発された高度な技術により、この問題を解決しました ¹⁾。Flipper TR™プローブは、その構造状態によって2種の全く異なる蛍光寿命を示します（図4）。低張力細胞膜に組み込まれたFlipper TR™プローブは半平坦化状態であると想定され、比較的短い蛍光寿命を示します。逆に、膜張力が高い場合、膜リン脂質圧によりFlipper TR™プローブが平坦化した高次構造へと変換し、これにより蛍光寿命が大幅に増大するためFLIM顕微鏡により定量し可視化することができます。Flipper TR™でプローブしたMDCK細胞を、0 から 0.6 mN・m⁻¹の浸透圧刺激により張力を増大させた状態にすると、蛍光寿命スロープΔが2.38 ± 0.18 ns・m・mN⁻¹でした ¹⁵⁾。Flipper TR™プローブは、膜張力だけでなく、膜脂質相や秩序液体 (Lo) または無秩序 (Ld)な状態の脂質を明らかにすることができることから、脂質ラフトを解明する手助けとなることが期待されます。

図4 Flipper TR™メカニズムのグラフィック表示
脂質充填と膜張力の変化により、
Flipper TR™プローブの平坦化状態が変化し、寿命の蛍光が変化します。

NRファミリープローブは、ナイルレッド色素を構造的に増強することにより開発されました。ナイルレッドと同様に、NRプローブは細胞膜に容易に挿入され、発光波長内でソルバトクロミックシフトを経ますが、特徴的な化学構造により増強された性能を持ちます（図5）。NR12Aは長鎖の親油性アルキル鎖、NR4Aは短鎖の親油性アルキル鎖であるスルホン酸基を含む、新規膜標的成分を利用します。またNR12AおよびNR4Aは、その前駆分子に存在する不安定なフェノール類の酸素基は欠如しています。
NR12AとNR4Aは、構造的には類似しているものの、NR4Aはより短鎖のアルキル鎖を持つことから細胞膜結合が容易に可逆できます。単一分子局在化顕微鏡法（SMLM）やナノスケール局所分布において、ナノスケール画像処理用に分光的に分解した点蓄積（SR-PAINT）を介した、細胞膜脂質秩序のナノスケールでの地図作成といった専用アプリケーションに使用されます。SR-PAINTにおいて、より短鎖のアルキル鎖とNR4Aの可逆的結合により、プローブが枯渇すると周囲の細胞培地から未使用の置換プローブを連続的に補充します。興味深いことに、NR4Aを使用することで、生細胞における形質膜陥入現象をナノスケールで動的に解像することができます ⁵⁾。これに対し、NR12AやNR12Sに存在するよりも長鎖の親油性アルキル鎖は、準不可逆的な結合を行うため、従来型の顕微鏡法に適しています。大規模な検証を行ったところ、NR12Sは脂質二重膜の外葉に対してより強い偏りを示し、形質膜陥入の内部移行は低く、数時間のうちにわずかな二者間の切り替えのみが認められました⁶⁾。NR12Sと、より新型のNR12A類似体を用いることで、困難で侵襲性の、不正確な細胞膜分画化アッセイを行うことなく、リアルタイムで脂質秩序を観察することができます。
以上より、新規蛍光NRプローブは、
1）生細胞画像処理において細胞膜特異性が高い
2）ソルバトクロミック青色シフトによりLo と Ld 局面間を区別が可能
3）それぞれのアプリケーションにおいて良好な光安定性と輝度を示し、バックグラウンドは低い
ことが特徴です。

図5 ソルバトクロミックな発光シフトを示すNRプローブ機序の模式図
NRプローブはLd脂質相に組み込まれ585 nm以上の波長で蛍光発光を示す。
これに対し、Lo相では585 nm以下の波長において青色シフト発光を示す。

過去40年にわたって、WGA誘導体から脂質類似体、さらに蛍光発生脂質や膜物理的センサーへと細胞膜染色用蛍光プローブが進歩してきました。
現在、最も進化したプローブは、バックグラウンドが低く、低毒性であり、また生物物理学的かつ高解像度の顕微鏡技術に使用されています。

■ CYTOSKELETON NEWS バックナンバー

• 2020年10月号　紡錘体 - 可視化に向けた新規ツール
• 2020年8月号　細胞膜染色用蛍光プローブ
• 2020年4月号　生細胞におけるF-アクチンプローブ
• 2020年3月号　コロナウイルスと細胞骨格
• 2020年2月号　タウ（Tau）の将来性をMapping
• 2020年1月号　Rho GTPaseによる細胞遊走制御

• 2019年12月号　表現型プロファイリング：アクチンに焦点を当てたがん治療
• 2019年11月号　チューブリンの過剰グルタミル化、ミトコンドリア、神経変性
• 2019年9月号　細胞運動性を制御するために相互作用する膜張力とアクチン細胞骨格
• 2019年8月号　Rac1B、がん、およびRac1
• 2019年7月号　Rhoファミリー GTPases、神経可塑性、およびうつ状態
• 2019年6月号　アクチンメチオニン酸化： 動的制御の次の段階
• 2019年5月号　ミクログリアと神経変性疾患
• 2019年2月号　生細胞画像化に対するCNS疾患や障害

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